哈尔滨圈养东北虎FHV-1的巢式PCR检测及gD基因序列分析

石龙艳 黄舒萍 郭 琳 李 祥 王 贤 陆雨欣 苏雨晴 徐海涛 周晓禹* 李大鹏 宫 明 王亚君*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.黑龙江东北虎林园，哈尔滨，150028)

猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type 1，FHV-1)是疱疹病毒科(Herpesviridae)、α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、水痘病毒属(Varicellovirus)的成员，是导致猫传染性鼻气管炎的病原体[1-2]。FHV-1在世界范围内广泛流行，自然情况可感染狮、虎和豹等多种猫科(Felidae)动物[3-5]。在家猫中发病率可达100%，幼猫病死率可达50%，患病后可能会终生携带并排毒，常发生反复感染，既可通过直接或间接接触水平传播，又可通过胎盘垂直传播[2，6]。患病虎的临床症状主要包括结膜炎、眼鼻出现浆液性分泌物和打喷嚏等一系列上呼吸道症状，如未及时采取正确的治疗措施可导致死亡[7-9]。临床上，猫科动物传染性鼻气管炎与猫泛白细胞减少症、猫支原体和猫杯状病毒感染等传染性疾病症状有相同之处，较难区分，需要通过分子生物学手段获得确切的诊断。由于免疫后出现再感染现象，临床上用检测病毒抗体作为诊断依据比较困难，核酸检测是最准确、灵敏、快速和高效的方法。目前，关于虎传染性鼻气管炎PCR检测已有报道[7-8，10]。本研究参考相关文献，利用巢式PCR对黑龙江东北虎林园圈养东北虎(Pantheratigrisaltaica)进行FHV-1检测，研究结果便于进一步了解圈养东北虎中FHV-1的感染情况，提高圈养猫科动物的管理水平。

1 材料与方法

1.1 样本来源

50份(只)东北虎全血样本均来自黑龙江东北虎林园，2019年1月—2021年3月由专业兽医采集。所有东北虎在采血前都禁食1 d，用含有10 mg/kg氯胺酮飞镖麻醉(中国江苏中牧倍康制药)，每只虎前肢静脉采集2 mL血液置于含有适量抗凝剂的采集管内，所有样品储存于-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

按照Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取试剂盒的说明书从全血中提取病毒核酸，并置于-80 ℃储存。

1.2.2 样本检测

首先使用以FHV-1的部分糖蛋白D基因(glycoprotein D，gD)为目标片段(283 bp)的巢式PCR方法[10]对50份样本进行逐一筛查，从阳性样本中随机选取2株进行普通PCR，以扩增完整的gD基因片段(1 125 bp)[11]。电泳鉴定后，将普通PCR样本送至吉林库美生物科技有限公司进行测序。引物序列及反应条件见表1。PCR扩增总体系25.0 μL，其中PCR Mix 12.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。

表1 引物序列信息

1.2.3 序列比对和数据分析

将测序结果与NCBI数据库收录的参考毒株进行BLAST比对分析，然后运用MegAlign进行核苷酸同源性比对。采用R 4.0进行数据分析，组间比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定结果

电泳结果显示，50份样本中有10份样本扩增到约283 bp的阳性目的条带，阳性率为20%(表2)。部分PCR产物电泳结果见图1。

表2 圈养东北虎样本信息及FHV-1阳性率

图1 圈养东北虎FHV-1巢式PCR扩增结果

2.2 同源性比较与系统进化分析

由于gD基因高度保守，巢式PCR所获得的10份阳性样本的283 bp片段同源性为98.9%～100.0%(图2)。随机选取其中2株阳性样本(H-16-1811、H-07-779)进行gD基因全序列扩增，对获取的1 125 bp序列进行BLAST分析，结果表明，2株阳性样本(GenBank登录号为ON211933和ON211934)的毒株序列与猫疱疹病毒Ⅰ型核苷酸同源性为99.2%～99.6%，与海豹鼻气管炎病毒(Phocid alphaherpesvirus)毒株核苷酸同源性仅为64.7%(图3)。从BLAST显示结果中选取3株FHV-1参考株(MH070348.1/Cat、OL410290.1/Cheetah和KJ466150.1/Tiger)进行核苷酸位点突变分析(表3)，发现获取的毒株序列与来自猫和猎豹(Acinonyxjubatus)的FHV-1参考株相比，有5个碱基位点发生了变异，与来自虎的参考株相比有6个碱基位点不同。

图2 10株圈养东北虎FHV-1 gD基因片段核苷酸同源性

图3 2株FHV-1 gD基因全序列核苷酸同源性差异

表3 阳性样本与参考株gD基因核苷酸差异

3 讨论

近年来，我国对东北虎的生存和保护措施逐步完善，然而引发圈养东北虎发病甚至死亡的病毒性传染病越来越多[12]。本研究应用巢式PCR对50份东北虎血样进行FHV-1检测，结果10份样本呈FHV-1阳性，阳性率为20%。此结果略高于之前的研究(17%)[13]，但低于尼泊尔自由放养孟加拉虎群(Pantheratigristigris)的血清学检测结果(35%)[4]。东北虎的FHV-1阳性率在年龄和性别之间无显著差异(P>0.05)，这与华南虎(P.t.amoyensis)的研究结果[9]相同，但FHV-1在猫中主要侵害仔猫[2，6]。gD蛋白是FHV-1已得到鉴定的8种囊膜糖蛋白之一，感染动物后，在宿主细胞的细胞膜上复制，是刺激机体产生抗体的重要结构蛋白之一，因此也被认为是亚单位疫苗的候选蛋白之一[14]。

同源性比对分析显示，本研究PCR扩增获得的gD基因1 125 bp与其他家猫和猎豹FHV-1参考株有着很高的同源性(99.2%～99.6%)，与来自虎的FHV-1参考株也有99.47%的高同源性。我国流浪猫数量庞大，在全国各地的动物园中居多。散养的东北虎虽然被铁丝网围住，但是由于网眼较大，流浪猫可以自由进出。虎园工作人员曾在园区看到过流浪猫，推测流浪猫与东北虎之间有密切接触的机会。FHV-1主要通过与受感染动物的体液(如鼻、眼和口腔分泌物)密切接触水平传播[15]，这就不排除FHV-1在流浪猫和东北虎之间存在交互传染的可能性。

近年研究表明，疱疹病毒的进化驱动来自于跨种传播及随后与宿主的共同进化，FHV-1毒株间也可发生重组[1，16]。FHV-1gD基因高度保守[11，17]，BLAST结果显示，在家猫和猎豹中100%同源，因此，本研究获取的gD基因序列与其他家猫和猎豹FHV-1参考株有着很高的同源性，但相比FHV-1参考株有5个碱基发生了突变，NCBI数据库中来自虎FHV-1的相应序列对比FHV-1参考株有1个碱基发生了突变，这表明东北虎群长期的FHV-1感染，在各种因素下可能导致FHV-1发生了突变，由于缺乏虎源传染性鼻气管炎毒株序列信息，目前无法进行系统的病毒溯源和遗传演化分析。

鉴于本研究及以往对东北虎感染FHV-1的报道[7，13]，表明圈养东北虎暴露于FHV-1易感环境中，甚至可能造成病毒的垂直传播，这对东北虎的繁育以及保护带来了极大威胁。FHV-1在猫中具有较高的流行率[11]，动物园是流浪猫的常见地，具备形成FHV-1传播途径的条件，圈养东北虎也暴露于传播链的风险之下。笔者认为首先要控制园内流浪猫的数量，对流浪猫定期捕捉、免疫和收容，其次优化园内的布局，减少流浪猫与圈养东北虎接触的机会。目前没有针对该病的有效疗法，主要以注射疫苗预防为主，还没有专门为东北虎设计的传染性鼻气管炎疫苗，多为东北虎接种家猫的商品化疫苗。对猫进行的FHV疫苗研究表明，在大多数情况下，用灭活或改良疫苗获得的抗体效价是短暂的[18]，多数出现免疫后再感染现象，这些疫苗对东北虎的免疫保护效果不明显[19-20]，猫科动物传染性鼻气管炎的防控仍然是一个棘手问题。同时，该病毒感染猫科动物后的临床症状与杯状病毒、细小病毒和衣原体感染后的症状相似，仅凭虎患病后的临床表现难以做出确切诊断，不乏有虎感染FHV-1后诊断错误，采取了不当的治疗方式而导致死亡的案例[7-8]，故而，研制出适合东北虎传染性鼻气管炎快速诊断的试剂盒迫在眉睫。