基于GEO数据库和网络药理学探讨柴胡-葛根治疗原发性青光眼的机制△

杨稀瑞 王继雪 袁星星 董霏雪 赵 辉

青光眼是世界范围内高致盲性眼病，其特征性表现主要为视野缺损及视神经萎缩[1-2]。据世界卫生组织统计，2013年世界范围内青光眼患病人数约为6400万人，至2020年全球青光眼患病率将升至2.86%，因此，青光眼的防治工作已成为全球亟待解决的重要公共卫生问题之一[3-4]。

目前认为，青光眼的病理特征为视网膜神经节细胞(RGC)进行性丢失及视神经变性，临床表现为视盘病变、视力下降及视野缺损[5]。视神经损伤作为青光眼最常出现的视神经改变，特征性表现为RGC凋亡及视野丧失[6]。RGC可将视觉信号通过视路传入大脑，其凋亡及程序性细胞死亡被认为是青光眼致盲的首要诱因[7]。因此，青光眼的治疗主要以阻断RGC凋亡，提高RGC存活率为主。此外，阻断青光眼中与RGC丢失相关的危险因素，减少RGC变性，同样是促进视神经存活的有效手段之一[8]。

基于此，本研究通过筛选GEO(gene expression omnibus)数据库及运用网络药理学手段分析药物有效成分及靶点，构建“药物-化合物-靶点”调控网络，并对其进行GO功能及KEGG富集通路分析，预测其治疗原发性青光眼的潜在靶点及作用机制，并以柴胡-葛根作为干预措施，通过观察RGC形态及其对PI3K/AKT信号通路的影响，以期进一步明确柴胡-葛根治疗原发性青光眼的作用机制。

1 材料与方法

1.1 柴胡-葛根活性成分筛选通过TCMSP数据库，以“柴胡”“葛根”作为检索词，选取2味中药所含的化合成分。以口服生物利用度(OB)≥30%及类药性(DL)≥0.18作为筛选条件，过滤获取中药的化合成分及对应的药物靶点。

1.2 药物-疾病靶点网络可视化分析利用GeneCards及OMIM数据库检索“Primary Glaucoma”，收集与青光眼相关靶点。在GEO数据库，以“Primary Glaucoma”为关键词，以“Homo sapiens”为限定物种，检索与青光眼相关的差异蛋白，运用Interactivenn平台将药物活性成分-疾病-差异蛋白进行交集处理，得到Drug-Disease-Target。通过R语言及Cytoscape软件对原发性青光眼进行火山图、热图及Drug-Disease-Target可视化网络分析的绘制。

1.3 构建蛋白互作网络将Drug-Disease-Target结果上传至String数据平台进行PPI网络分析。设定最低互动分数为0.400。运用Cytoscape软件进行PPI蛋白互作网络可视化分析。

1.4 GO功能及KEGG富集分析将Drug-Disease-Target结果上传至David平台进行GO功能和KEGG富集分析，并通过OmicShare平台和Cytoscape软件对GO功能和KEGG富集分析结果进行可视化。

1.5 实验动物及细胞清洁级BALB/c小鼠(8～10周龄)16只，体重8～10 g，经专科检查确认未出现眼部疾患。小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物合格证批号：SYXK(京)：2016-0011]。采用小鼠专用饲料，以专用笼喂养，小鼠适应性喂养3 d。小鼠RGC购自武汉普赛诺生命科技有限公司，置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中进行培养。

1.6 主要药品及试剂柴胡、葛根购自北京同仁堂，于蒸馏水内浸泡1 h，煎药机文火煎煮2次，取汁备用，纱布滤过2次，80 ℃水浴中制备成每1 mL含生药1 g的药汁混悬液，4 ℃冰箱保存。RNA提取试剂盒购自美国Thermo公司(货号12183016)，反转录试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司(货号D7168S)。

1.7 分组、造模及给药BALB/c小鼠16只随机分为药物组和对照组，每组8只。按照血清药理学公式计算，药物组小鼠每日灌胃1 mL·kg-1中药混悬液，对照组每日灌胃1 mL·kg-1蒸馏水,每日灌胃1次，连续5 d。于第5天灌胃结束后予以禁食，次日晨再灌胃1次，1 h后采血，分别提取两组小鼠的血清备用。将纯化培养48 h的RGC随机分为4组，分别为空白组、模型组、空白+中药组、模型+中药组，其中，模型组、模型+中药组RGC参照文献[9]采用800 μmol·L-1过氧化氢(H2O2)处理12 h诱导氧化应激损伤模型，空白组和模型组RGC以稀释10倍后的对照组小鼠血清继续培养48 h，空白+中药组、模型+中药组RGC以稀释10倍后的药物组小鼠血清继续培养48 h。

1.8 细胞形态学取对数生长期RGC，调整细胞密度为1×106个·mL-1，取0.5 mL，PBS缓冲液漂洗2遍，加入1.0～1.5 mL消化液消化、离心后接种于培养皿，同1.7中分组处理，分别于培养12 h、24 h及48 h后，通过倒置相差显微镜观察各组RGC形态。

1.9 RT-PCR检测培养48 h后，使用TRlzol试剂提取各组细胞中总RNA，再将提取的总RNA反转录成cDNA，并于-20 ℃保存备用。以β-actin为内参，检测PI3K和AKT mRNA的表达。PCR反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，73 ℃ 10 s，共50个循环。PI3K引物序列：正向为5’-TATTTGGACTTTGCGACAAGACT-3’，反向为5’-TCGAACGTACTGGTCTGGATAG-3’；AKT引物序列：正向为5’-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3’，反向为5’-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3’;β-actin引物序列：正向为5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，反向为5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’。

2 结果

2.1 柴胡-葛根活性成分筛选结果通过检索TCMSP数据库，共获得柴胡、葛根相关成分367个，其中满足OB≥30%的成分共有185个，满足DL≥0.18的成分共有76个，同时满足OB≥30%与DL≥0.18的活性成分为21个。

2.2 原发性青光眼的作用靶点通过检索共筛选出2743个与原发性青光眼相关的靶点。通过二次挖掘GEO数据库，并以芯片GSE9944为数据原始文件进行比较。以R语言进行差异基因的分析，共获得659个显著改变与影响的基因，其中上调基因284个，下调基因375个。将两个数据库获得的青光眼靶点与R语言分析筛选出的差异表达基因进行交集，再与中药有效活性成分的作用靶点进行交集，最终获得与原发性青光眼相关的差异蛋白靶点63个，主要包括IL-6、VEGFA等(图1)。

2.3 GO功能及KEGG富集分析结果采用David平台对药物-疾病行GO功能及KEGG富集分析，并将P值较小的GO生物过程与KEGG通路行可视化分析。柴胡-葛根-青光眼GO功能分析见图2，由图可知，柴胡-葛根治疗原发性青光眼的生物学过程与蛋白结合、催化、有机环状化合物结合及有机物代谢过程等有关。柴胡-葛根-青光眼KEGG富集分析见图3，由图可知，柴胡-葛根主要通过调节PI3K-AKT、TNF、MAPK、VEGF、JAK-STAT等信号通路发挥治疗原发性青光眼的作用。通过Cytoscape软件对药物-疾病-通路网络进行可视化分析结果见图4。

图2 柴胡-葛根-青光眼GO功能分析柱状图

图3 柴胡-葛根-青光眼KEGG富集分析结果

图4 柴胡-葛根-青光眼-通路分析图

2.4 倒置相差显微镜下观察各组RGC形态培养12 h后，空白组RGC逐渐贴壁，细胞体呈卵圆形，立体感强，折光率高；模型组RGC缓慢贴壁，细胞体出现变形，折光率低；模型+中药组RGC缓慢贴壁，立体感较强；空白+中药组RGC逐渐贴壁，细胞体呈卵圆形，立体感较强。培养24 h后，空白组RGC基本贴壁，生长迅速，细胞体饱满，周围出现明显光晕，呈单层排列，大部分RGC汇聚成团，部分RGC可见其膜上突出的圆锥形隆起，呈现不规则状；模型组RGC基本贴壁，生长缓慢，细胞体饱满程度欠佳，周围少见光晕，部分细胞出现聚集；模型+中药组RGC基本贴壁，生长速度正常，细胞体较为饱满，周围出现少许光晕，呈单层排列，可见部分细胞聚集；空白+中药组RGC基本贴壁，细胞呈现快速生长趋势，细胞体饱满，周围可见光晕，部分细胞聚集成团，少数细胞膜伸出圆形或锥形突起。培养48 h后，空白组RGC完全贴壁，可见明显聚集性生长，呈团状或串珠样排列，细胞体变大，突起增长；模型组RGC完全贴壁，呈现分散性增长，细胞体排列极不整齐，且细胞体较小，未见显著突起；模型+中药组RGC完全贴壁，可见少量聚集性生长，出现串珠样排列，细胞体缓慢增大；空白+中药组RGC完全贴壁，细胞可见显著聚集性生长，呈现团状或串珠样改变，排列较为整齐，细胞体增大(图5)。

图5 不同时间点各组RGC形态 A：空白组；B：空白+中药组；C：模型组；D：模型+中药组。

2.5 柴胡-葛根对RGC各因子mRNA表达的影响RT-PCR检测结果显示，与空白组相比，空白+中药组RGC中PI3K和AKT mRNA表达均下降，模型组、模型+中药组RGC中PI3K和AKT mRNA表达均升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；与模型组相比，模型+中药组RGC中PI3K和AKT mRNA 表达均下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 各组PI3K、AKT mRNA表达比较

3 讨论

中医认为青光眼属“五风内障”范畴，诊疗历史悠久，最早可追溯至《神农本草经》，经历代医家不断研究发现，中医药对青光眼所造成的视神经损伤具有保护作用，且呈多组分、多靶点、整体化趋势，但尚缺乏对中药复方的标准化规范，且临床评价不一，基础研究不完善及机制不明确。因此，对于青光眼视神经保护治疗的中药种类及疗效存在局限性，仍需通过更高水平的基础及临床研究加以完善。

柴胡作为升散之品，善于疏肝解郁，通窍明目，引药上行，通达于目；葛根升举阳气，引药入目，上达清窍，可助柴胡疏肝理气，开窍醒神。现代药理学研究证实，柴胡能够抗炎、调节免疫、修复RGC。此外，柴胡还能够抑制炎症细胞浸润，降低血清内TNF-β及IL-6表达[10]。葛根富含葛根素，能有效改善眼底微循环、调节眼底微血管的活力，提高眼底组织缺血缺氧的能力，葛根中的异黄醇甙能够稳定眼底缺血区活性，解除因缺血所致的眼底微血管痉挛，恢复眼底血管舒缩，促进眼内侧支循环建立。

本研究通过GEO数据分析发现，IL-6、VEGFA等在PPI网络中Degree值排名靠前，由此推测上述蛋白可能是原发性青光眼治疗的主要靶点。IL-6作为常见的促炎因子，贯穿炎症反应的全过程。主要由活化的T细胞、单核巨噬细胞等分泌，参与免疫调节，刺激造血细胞的生长及分化等[11]。IL-6受体可分为IL-6Rα及gp130两种，可通过与gp130的结合，激活JAK酪氨酸酶及其转录因子的活性，抑制Bcl-2及Bcl-xL的凋亡[12-13]。GO功能分析结果显示，治疗原发性青光眼的生物学过程与蛋白结合、催化、有机环状化合物结合及有机物代谢过程等有关。KEGG富集分析结果发现，柴胡-葛根治疗原发性青光眼的作用机制可能与PI3K-AKT等信号通路的调节相关。现有研究发现，激活PI3K-AKT信号通路能够抑制RGC凋亡，PI3K的调控可以激活AKT，抑制Caspase-9表达，降低RGC凋亡；此外，在慢性高压眼大鼠模型中，Caspase-9的表达上调会促进RGC损伤，通过下调PI3K-AKT信号通路中p-FoxO1及IKK2的表达，同样会抑制RGC的凋亡[14]。

本研究以柴胡-葛根干预治疗H2O2所诱导的RGC，并在倒置相差显微镜下观察培养不同时间点的RGC形态变化，结果发现，培养12 h、24 h、48 h后，模型+中药组RGC从缓慢贴壁到完全贴壁，并可见少量聚集性生长及串珠样排列，细胞体缓慢增大；空白+中药组RGC完全贴壁，细胞可见显著聚集性生长，呈现团状或串珠样改变，排列较为整齐，细胞体增大。继续采用RT-PCR法检测RGC中PI3K和AKT mRNA表达水平，发现柴胡-葛根能够显著抑制RGC中PI3K和AKT mRNA表达。

综上所述，通过对“柴胡-葛根”治疗原发性青光眼进行GEO差异分析，可初步预测柴胡-葛根治疗原发性青光眼的药理机制；细胞实验结果证实，柴胡-葛根通过抑制PI3K-AKT信号通路抑制细胞凋亡，起到改善原发性青光眼的作用。