调节性细胞死亡在糖尿病视网膜病变中的研究进展△

2022-08-12刘昱麟马贤德宋采秋

眼科新进展 2022年8期

刘昱麟马贤德宋采秋赵磊左韬

细胞在受到外界刺激后，可产生两种细胞死亡方式，即意外细胞死亡(ACD)和调节性细胞死亡(RCD)，ACD是由于外界刺激超出细胞自我调节范围，进而产生的一种不受生物学控制的细胞死亡方式；RCD是细胞对外界刺激所做出的调节性应答，是一种有众多蛋白参与，信号级联诱导的细胞死亡方式。糖尿病是一种严重威胁人类健康的全球性疾病，据统计，截至2019年，约5亿人口患有糖尿病[1]。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病引起的一种严重的微血管并发症，其病理特征包括新生血管、周细胞丢失、血管内皮细胞异常及血-视网膜屏障破坏、神经元血管单元破坏和视神经异常等[2]。DR是全球第四大致盲性疾病[3]，最新的流行病学调查显示，全球约有27%的糖尿病患者会出现DR[4]，因此，如何靶向预防DR，减缓DR的发展进程，保护患者视觉功能已成为现代医学研究的重点之一。

1 细胞凋亡与DR

细胞凋亡的发生，是以细胞核固缩，细胞皱缩，染色体DNA被切割成片段，最终形成凋亡小体为特点的一种RCD。细胞凋亡是细胞正常的生理现象，与细胞增殖、细胞生长发育、细胞衰老等密切相关。细胞凋亡受基因调控，细胞在生长发育过程中，为了保证机体正常的生理功能，某些不必要的细胞(包括发育异常的细胞、有害细胞、衰老细胞等)将会在细胞内相关信号调控下，产生自发性的死亡[5-6]。

诱导细胞凋亡的信号包括线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径。正常情况下，细胞内的促凋亡机制与抑凋亡机制处于平衡状态。线粒体途径是指凋亡启动机制激活，或者凋亡抑制机制失活，致使线粒体膜的通透性改变，激活细胞内的某些信号，如Bcl-2家族介导细胞色素C生成[7]，细胞色素C又能激活凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)，使其募集ATP或dATP形成蛋白多聚体结构[8]，诱导半胱氨酸天冬酶的前体(pro-caspase)结构激活下游caspase-3、caspase-7、caspase-9，最终导致细胞凋亡基因表达[9-10]。内质网途径是指细胞内质网异常而引起的细胞凋亡，当内质网钙离子失衡，可导致内质网内蛋白异常积聚并募集大量的pro-caspase-12，pro-caspase-12在caspase-7的作用下，激活caspase-12，而后启动caspase-3，促使凋亡发生。死亡受体途径是指细胞受到外界理化因素刺激后，介导半胱氨酸序列如死亡受体(Fas结构)表达。Fas的配体(FasL)与自然杀伤细胞或T淋巴细胞表面识别信号结合，联合Fas结构形成蛋白多聚体进入细胞内[11]，激活死亡诱导信号复合物,活化caspase-3，启动外源性细胞凋亡[12-13]。

Chen等[14]研究发现，黄连素可以通过上调Bcl-2，下调Bax和caspase-3的表达水平抑制高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡。Valverde等[15]研究发现，与正常组相比，糖尿病患者的视网膜中促凋亡分子FasL、caspase-8、caspase-3的表达水平显著增加。Valverde等[16]认为，DR出现的血-视网膜屏障破坏是由白细胞介导Fas-FasL途径促使视网膜血管细胞发生凋亡引起的，而抑制FasL能够有效保护视网膜血管内皮细胞的损伤、凋亡和血-视网膜屏障的完整。Hernández等[17]研究发现，DR大鼠视网膜中促凋亡信号FasL、caspase-8、caspase-3和 Bcl处于过表达状态，生长抑素滴眼液可以降低DR大鼠视网膜细胞水平，预防糖尿病引起的视网膜退行性病变。因此，凋亡相关蛋白的研究可能有助DR的靶向治疗。

2 铁死亡与DR

铁是维持机体生命活动最重要的微量元素之一，与机体氧气运输，DNA、ATP的合成都密切相关，因此维持体内铁的含量与铁的稳态至关重要[18]。铁死亡是一种以细胞内脂质活性氧(ROS)堆积为特点的铁依赖性的RCD，在铁失衡状态下，可以出现线粒体皱缩、嵴减少或者消失、膜增厚等细胞形态的改变，这些改变都是细胞功能异常的缩影。研究表明，铁死亡在神经系统性疾病、糖尿病、肿瘤、眼科疾病等多种疾病的调控过程中都发挥着关键的作用[19]。

由于铁是影响内环境稳态的关键，虽然细胞铁死亡过程中有诸多蛋白参与，但是细胞铁死亡的诱因主要为铁代谢紊乱(包括胱氨酸转运途径、代谢途径和脂质代谢途径出现的紊乱)[20-21]。当细胞处于氧化条件时，System xc-转运体能将胱氨酸或半胱氨酸作为谷胱甘肽(GSH)的合成原料转运到细胞内，随后在GSH或硫氧蛋白还原酶的作用下，胱氨酸被还原为半胱氨酸，GSH合成酶与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶能调控半胱氨酸生成GSH，GSH与谷胱甘肽过氧化物酶4结合，还原磷脂氢过氧化物(PL-OOH)，在其他酶作用下进而又生成GSH[22-23]。而当细胞铁代谢障碍时，GSH循环出现异常，PL-OOH堆积，导致细胞能量代谢出现紊乱，引发细胞铁死亡。另外，人体内铁的蓄积和使用与铁蛋白的调控密切相关。Fe2+能诱导细胞内脂质的氧化还原反应，从而引起细胞铁死亡。参与细胞脂质还原反应的铁来自于细胞溶酶体内的可变铁池对铁的蓄积，某些蛋白可以通过对铁蛋白进行降解，增加可变铁池对游离铁的蓄积水平，以诱导细胞产生铁死亡。在细胞脂质代谢途径中，主要通过铁失衡所引发的氧化反应[24]，激活ROS启动铁死亡的过程[25]。另有研究表明，核转录因子(Nrf2)也是铁死亡过程中的关键蛋白[26]，Nrf2入核，能通过对铁死亡相关蛋白的转录的调节，诱导细胞铁死亡。

研究表明，血清铁含量与DR的发生呈负相关趋势[27]。Chaudhary 等[28]研究发现，与正常小鼠相比，1型和2型糖尿病模型小鼠视网膜铁积累增加；并且人糖尿病患者的视网膜样本中同样出现了铁积累。可见，维持铁的稳态与DR的预后密切相关。由于DR可能与视网膜神经节细胞的异常有关，Yang等[29]通过对视网膜内的关键细胞——小胶质细胞进行高糖诱导后发现，藏红花苷能显著降低细胞中的ROS，降低氧化应激状态。Ochiai等[30]发现，藏红花苷能增加细胞内GSH水平，减少细胞死亡。视网膜内周细胞数量降低与DR的发生密切相关[31]。Wang等[32]通过高糖诱导细胞后发现，DJ-1过表达能通过调控Nrf2的表达水平，增加细胞抗氧化能力，增加周细胞活性，沉默Nrf2基因后ROS生成增加。因此，铁死亡可能与DR的发病机制密切相关。

3 细胞焦亡与DR

细胞焦亡是一种以炎症小体激活为基础的RCD，在细胞炎症反应与免疫应答中发挥着重要的作用。当机体受到外界刺激导致细胞感染或损伤发生后，能调控炎症小体相关蛋白装配，进一步诱导细胞发生炎症级联反应，产生一系列细胞形态学改变，即细胞膜孔隙开放使细胞膜渗透性增高，细胞肿胀后破裂坏死，细胞内部成分随即释放于细胞外，这些形态改变能引起局部炎症反应加重，促炎因子分泌增加。

根据调控炎症小体装配、激活的路径差异，将细胞焦亡分为经典caspase-1依赖途径与非经典的caspase-11依赖途径。经典caspase-1依赖途径是由损伤相关分子模式、病原体相关分子模式或其他免疫应答所激活，诱导启动蛋白Nod样受体家族或非Nod样受体家族蛋白,例如NLRP3、AIM2[33]，结合凋亡相关斑点样蛋白 (ASC)与 pro-caspase-1形成炎症小体[34],激活caspase-1，使其对GSDMD进行切割，产生GSDMD-N，而后GSDMD-N与细胞膜内部结构域结合，诱导细胞膜孔隙形成，最终使得细胞发生裂解[35-37]。与此同时，caspase-1还能激活白细胞介素(IL)-1β进一步加重炎症反应。非经典的caspase-11依赖途径是由于机体受到刺激后，细胞分泌的LSP诱导caspase-11等蛋白活化，从而对GSDMD进行切割,产生GSDMD-N。GSDMD-N不但能够诱导细胞裂解，并且能使NLRP3、ASC、pro-caspase-1聚合为炎症小体，活化caspase-1，进一步加重炎症反应[38]。

研究表明，DR与细胞焦亡有着十分密切的关系。Loukovaara 等[39]研究发现，与正常人相比，DR患者视网膜内含有的NLRP3明显增多，且DR患者通过抗VEGF治疗后，视网膜内所含有的caspase-1水平明显降低。Zhang等[40]通过对DR患者的视网膜增殖膜进行研究，发现了NLRP3、caspase-1、IL-1β等细胞焦亡相关蛋白表达水平增高，而当加入NLRP3的抑制剂后，可发现炎症小体的激活受到抑制，并且下游炎症因子的表达水平也随之降低。Gu等[41]研究发现，在高糖诱导的DR模型中，细胞焦亡的发生可能是通过IL-1β相关的正反馈通路激活了NLRP3 /NLRP1/NOX4/ROS的表达水平，诱导细胞发生焦亡。Gan 等[42]研究发现，GSDMD被切割后，能导致视网膜内周细胞丢失，造成视网膜血管增生与血管畸形。上述研究结果都证实，细胞焦亡的发生与DR患者的病理过程密切相关。

4 自噬与DR

自噬是一种以细胞自我吞噬为特点的RCD。通常情况下，细胞的自噬分三种，但目前我们所指的自噬以巨自噬为主。细胞生命活动过程中，当受到低氧、感染、营养匮乏等刺激时，细胞内的某些双层膜结构，例如内质网、高尔基体等，可以包绕细胞器形成自噬体，将细胞中不必要的成分降解为小分子能量物质，并将这些物质提供给细胞质，以维持细胞的基本功能[43-44]。正常情况下，细胞的自噬始终维持着一个稳态，细胞对于病变细胞器和异常积聚的大分子等物质进行有序的自噬调控，实现了细胞生长、发育、代谢等一系列的过程。而应激或者病理状态下，自噬能通过对衰老病变细胞的清除，降低刺激对细胞的损害。过度自噬或自噬时间过长，会导致蛋白质和细胞器的超量破坏，使细胞更新和代谢之间的平衡被打破，出现自噬性RCD[45-46]。

参与自噬的信号通路主要由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)构成。mTOR是一种保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是调节细胞生长、发育、代谢、运动、自噬等的活动的上游靶位点，正常状态下mTOR处于激活状态。mTOR激酶可以特异性作用于自噬DNA，调节自噬过程，激活下游信号，启动相关基因的转录和调控[47]。自噬的过程主要经历启动、囊泡延伸、膜融合、囊泡溶解四个阶段。Unc-样激酶1 (ULK-1)对细胞能量敏感。启动阶段，细胞在营养匮乏的情况下，AMPK能抑制mTOR信号，调控ULK-1激活，ULK-1能迅速与自噬相关基因(ATG)1、ATG17形成复合物促进自噬发生[48]。PI3K是细胞内重要的自噬调节信号，PI3K分三类，主要通过III型PI3K复合物招募ATG14 、Vps34[49]、 Beclin-1和P150等调控自噬体的形成。自噬体囊泡延伸阶段，ATG12和ATG5、在ATG7、ATG10的催化作用下，与ATG16结合形成ATG12-ATG5-ATG16复合物结构[50-53]。膜融合阶段，主要由LC3(酵母内ATG8的同源物质)参与。LC3能在ATG4的催化作用下形成LC3Ⅰ,随后LC3Ⅰ在ATG7与ATG3的参与下与磷脂酰乙醇胺(PE)相结合形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ可以附着在自噬体上，促使自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体结构。囊泡溶解阶段，自噬溶酶体中的内容物在ATG15的参与下经由溶酶体水解酶介导，最终降解成氨基酸等营养物质。

研究表明，DR与细胞自噬有着十分密切的关系。Lopes等[54]发现，DR患者自噬相关蛋白Beclin-1、P62的表达量增加，且mTOR的抑制剂能减轻视网膜细胞的自噬损伤。视网膜Müller细胞的炎症、氧化应激、凋亡和DR患者的细胞自噬密切相关，Zhou等[55]研究发现，三七皂苷可以上调高糖诱导的Müller细胞和小鼠视网膜中的PINK1和Parkin水平，提高LC3-II/LC3-I比值，下调p62/SQSTM1水平，从而降低细胞自噬，保护视网膜血管及视网膜功能。Chen等[14]研究发现，高糖能促进视网膜Müller细胞自噬，提高细胞内Beclin-1和LC3II的表达水平，激活AMPK/mTOR信号通路；黄连素通过AMPK/mTOR信号通路来保护视网膜Müller细胞免受损伤。Qi等[56]研究认为，视网膜内稳态受昼夜调节，正常情况下，自噬相关蛋白处于24 h规律表达，而DR大鼠自噬相关蛋白随着大鼠昼夜节律而发生改变，因而恢复大鼠昼夜节律可能与DR的预后相关。因此，DR大鼠的细胞自噬水平是DR预后的关键，如何恢复细胞的过度自噬，可能是未来DR研究的新方向。

5 依赖性细胞死亡与DR

依赖性细胞死亡(Parthanatos)，是一种聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)依赖为特点的RCD。生理状态下，PARP-1能修复DNA损伤并参与DNA的转录过程。细胞在生命活动中受到化学物质或氧化应激产物刺激时，能启动PARP-1，引发细胞内DNA广泛受损，最终诱导细胞死亡机制[57]。研究表明，依赖性细胞死亡在多种疾病中都发挥了重要作用，包括炎症、脑缺血-再灌注损伤、阿尔茨海默病、糖尿病等[58]，某些内源性刺激，如缺血-再灌注损伤等，能通过释放大量兴奋性神经递质诱导PARP-1激活[59]，这些刺激诱导钙离子内流，促进一氧化氮及ROS生成[60-61]，ROS可以结合一氧化氮形成大量过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)[62]，导致DNA残缺，PARP-1活化[63]；而某些外源性的刺激，如电离辐射等，同样也能活化PARP-1。当PARP-1由多种途径激活后，能诱导下游聚腺苷酸二磷酸核糖(PAR)聚集，并进一步引起线粒体凋亡诱导因子从线粒体释放，并携带巨噬细胞移动抑制因子去细胞核，最终剪切染色体DNA，执行细胞死亡任务。也有其他研究认为， PAR能修饰蛋白电荷分布，从而抑制蛋白质功能，诱发细胞死亡[64]。Kanai等[65]认为，PARP-1介导p53多聚体集聚也是引发DNA损伤的关键。

目前，虽然依赖性细胞死亡与DR相关的直接研究较少，但是与DR发生相关的前驱病变，如神经、血液屏障异常等机制中都发现了依赖性细胞死亡的参与[66]。视网膜神经退行性病变是DR致盲的关键，雪旺细胞(又称施万细胞,Sc)是存在于视网膜神经内的神经胶质细胞。研究表明，在高糖诱导下，Sc能出现依赖性细胞死亡相关蛋白的高表达；而富氢介质可减轻高糖诱导的大鼠Sc的ONOO-，AIF的表达水平。视网膜缺血-再灌注损伤也是DR的机制之一[67]。研究表明，视网膜缺血-再灌注损伤过程中，出现了DNA损伤和PARP-1的过表达[68]。Mohammad等[69]和Obrososva等[70]通过研究发现，糖尿病患者的视网膜内有PARP-1的高表达。上述研究表明，依赖性细胞死亡与DR可能存在极大相关性，所以依赖性细胞死亡将可能是调控DR的新方向。