三叶因子3在不同组织类型宫颈癌中的差异表达及临床意义

谭 尧 熊雨静 徐 檬 颜 彬 曹 璜 胡俊波 吴绪峰 王汉明

1武汉科技大学医学院 湖北 武汉 430062；2华中科技大学同济医学院附属湖北妇幼保健院 湖北 武汉 430070

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，2020年全球估计新增宫颈癌患者60.4万人，死亡病例约34.2万［1］。近年来宫颈鳞癌的发病率在显著下降，但宫颈腺癌发病比例则逐年上升，宫颈腺癌与宫颈鳞癌呈现明显不同的生物学行为，相比较鳞癌，人们对腺癌的认识存在明显不足。TFF3是三叶因子家族（Trefoil factor，TFFs）蛋白成员之一，主要分布于小肠和结肠的杯状细胞［2］，具有调节细胞凋亡、促进黏膜修复、促进肿瘤侵袭等功能［3］，已证实其在多种其他组织腺癌中表达，并与肿瘤恶性程度、预后不良密切相关［4，5］。已有文献报道过表达TFF3可促进宫颈癌细胞株的增殖与抗凋亡［6］，但TFF3在不同宫颈癌组织类型的表达及其临床意义尚不明确。该文采用免疫组化的方法进一步探讨TFF3在宫颈癌组织标本中的表达及其临床意义，为全面认识TFF3在宫颈癌中的功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料标本来源于2008—2018年湖北省妇幼保健院病理科存档的98例宫颈癌组织蜡块，均有完整的临床资料与随访资料。宫颈腺癌组共48例，患者年龄17～75岁，中位年龄44岁；临床分期Ⅰ期40例、Ⅱ～Ⅲ期8例；分化程度G1期21例，G2～G3期27例；肿瘤直径＜4 cm 32例，肿瘤直径≥4 cm 16例；其中腺癌手术治疗20例，发现淋巴结阳性3例，脉管侵犯5例。宫颈鳞癌组共50例，患者年龄27～85岁，中位年龄50岁；临床分期Ⅰ期15例、Ⅱ～Ⅲ期35例；分化程度角化型21例，非角化型27例；肿瘤直径＜4 cm 21例，肿瘤直径≥4 cm 29例；其中鳞癌手术治疗32例，发现淋巴结阳性7例，脉管侵犯15例。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学（SP）法 兔抗人TFF3单克隆抗体（EPR3974）购自美国Abcam公司（工作浓度为2μg/mL）；通用二步法检测试剂盒（PV-9000）、DAB显色试剂盒（ZLI-9017）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。切片染色前根据要求行柠檬酸缓冲液高温抗原修复，其余操作过程均按试剂盒说明书完成。

1.2.2 图像采集与分析 采用徕卡™DM 4000显微镜观察并获取图像。Image J（NIH，Bethesda，Maryland，版本号1.48）进行阳性定量分析［7］，原始彩色图像解卷积产生DAB图像和苏木素图像。DAB显色图像以光密度（OD）值分析，OD值强度范围为0～255。背景纯白OD值接近0，DAB着色越深OD值越大，表明物质的量越多。其中OD值范围0～55为阴性，56～115为弱阳性（+），116～175为强阳性（），176～235为强阳性（）。根据下列公式计算图片免疫组化总得分。评分=（染色面积×该染色强度得分）/总面积。

此外，在区域中≥66%像素百分比的图像都将被直接分配该区域的分数。同时将图片上各点的OD值累加起来，即为积分光密度值（IOD值），此值与检测物质的总量成正比。IOD值除以目标分布区域面积，得到平均光密度值（AOD值），此值反映了目标物质的单位面积浓度。

1.3 统计学分析采用SPSS 24.0统计软件分析数据，定量资料符合正态分布的以均数±标准差（±s）表示，组间差异性的统计推断采用t检验；非正态分布以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，组间差异性统计推断采用非参数秩和检验。计数资料组间差异采用卡方检验，计算卡方和P。患者术后生存率的评价采用生存曲线分析，生存曲线、散点图的统计检验采用GraphPad Prism 8软件。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TFF3在宫颈鳞癌与腺癌中的表达TFF3主要表达于宫颈癌细胞胞质中，宫颈腺癌与宫颈鳞癌中均有表达（见图1A、1B）。TFF3在宫颈癌组织表达的平均IOD、平均AOD分别是2.39×106、0.87，表达阳性率为100%（98/98）。其中鳞癌组织中TFF3表达的平均IOD、平均AOD分别是1.45×106、0.63；宫颈腺癌组织中TFF3的平均IOD、平均AOD值分别为3.37×106、1.12，二者间存在显著差异（P＜0.05）（见图1C、1D）。宫颈 腺癌患者 的TFF3强阳性34例，阳性14例，强阳性表达率70.83%；宫颈鳞癌组强阳性6例，阳性44例（其中弱阳性6例），强阳性表达率仅为12%，两者差异具有统计学意义（P＜0.001）。见表1。

图1 TFF3在宫颈腺癌与鳞癌中表达水平比较

表1 TFF3在宫颈腺癌与鳞癌中表达水平比较

2.2 宫颈癌患者中TFF3表达与临床病理参数间关系通过研究，可知TFF3的表达强度与宫颈癌患者年龄、临床分期、脉管侵犯有一定关系。在宫颈癌组织中，年龄＜45岁、年龄≥45岁TFF3的IOD中位数分别为2.62×106、1.59×106，二者间存在显著差异（P＜0.05）。FIGO分期Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期TFF3的IOD中位数分别为2.62×106、1.62×106，二者间存在显著差异（P＜0.05）。有脉管侵犯、无脉管侵犯TFF3的IOD中位数分别为2.55×106、1.26×106，二 者 间 存 在 显 著 差 异（P＜0.05）。TFF3的表达强度与宫颈癌患者分化程度、淋巴结阳性、肿瘤直径无明显关系（P＞0.05），具体结果见表2。

表2 宫颈癌患者中TFF3表达与临床病理参数间的相关性

2.3 宫颈鳞癌患者中TFF3表达与临床病理参数间关系在宫颈鳞癌中，TFF3的表达强度与宫颈鳞癌患者临床分期、肿瘤直径有关，其中，FIGO分期Ⅱ～Ⅲ期的IOD中位数为1.53×106，明显高于Ⅰ期（1.03×106），差异具有统计学意义（P＜0.05）。肿瘤直径≥4 cm的IOD中位数为1.54×106，明显高于肿瘤直径＜4 cm（1.13×106），差异具有统计学意义（P＜0.05）。TFF3的表达强度与宫颈鳞癌患者年龄、分化程度、淋巴结阳性、脉管侵犯无关（P＞0.05），具体结果见表3。

表3 宫颈鳞癌患者中TFF3表达与临床病理参数间相关性

2.4 宫颈癌患者中TFF3表达强度与手术预后的关系对所有宫颈癌手术患者IOD值取其中位数，低于中位数则为低表达组，高于中位数则为高表达组。通过分析，低表达组中位生存期为4.4年，高表达组中位生存期4.0年，差异不具有统计学意义（P＞0.05），可知TFF3的表达强度与宫颈癌患者预后无明显关系，具体结果见图2。

3 讨论

近年来，随着宫颈防癌筛查的普及和HPV疫苗的应用，宫颈癌发病率和死亡率显著降低［8］。但宫颈腺癌发病率和死亡率则逐年上升且有年轻化的趋势。20世纪50年代，美国宫颈腺癌占总宫颈癌的比例约为5%，现在则已达20%～30%［9］，约60.3%的宫颈腺癌患者年龄小于50岁，其中超过50%患者小于40岁。目前，宫颈腺癌的死亡率较同期鳞癌高20%以上［10］，这可能与宫颈腺癌的恶性生物学行为相关，并非所有的腺癌都有人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的感染，而腺癌病变位置较深，现有的筛查手段诊断效果欠佳［11］，腺癌对化疗和放疗敏感性较鳞癌低［12］。因此对宫颈腺癌进行更深入的研究对改善宫颈腺癌患者的预后有重要的意义。

TFF3在多种组织腺癌中高表达，且与肿瘤不良预后密切相关。如在原发性胃癌中TFF3表达量越高提示患者预后越差［13］。在早期胰腺癌中，TFF3的表达量随着疾病的进展逐渐增高［14］。在肺癌中，TFF3在肺腺癌中高表达，而在肺鳞状细胞癌中低表达，其表达差异为明确肺癌组织学类型提供了特异性标记物［15］。目前在妇科恶性肿瘤中TFF3研究报道较少。宫颈癌中，Yuan等［16］通过上调TFF3的表达抑制了HeLa细胞的凋亡，并促进细胞增殖和侵袭。徐昕［17］同样在宫颈癌细胞系中探究发现TFF3通过激活PI3K/Akt信号通路进而激活Twist1基因的表达，从而促进宫颈癌细胞增殖、迁移，并抑制其凋亡。周秀枝［18］在正常宫颈、低级别宫颈鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别宫颈鳞状上皮内病变（HSIL）及宫颈癌组织中检测TFF3的表达，明确TFF3与宫颈病变的进程密切相关。本研究发现，宫颈腺癌组织中TFF3的IOD值及AOD值显著高于鳞癌组织，宫颈腺癌患者的TFF3强阳性表达率（70.83%）明显高于鳞癌组织（12%），说明TFF3表达水平与宫颈癌组织病理学类型密切有关，宫颈腺癌中TFF3表达水平明显高于鳞癌，这与Qu等［15］在肺癌组织分型中发现腺癌TFF3表达量高于鳞状细胞癌的结果相符。TFF3在宫颈癌组织中的差异性表达，以及在腺癌中的高表达，结合Yuan等［16］已经证实TFF3与腺癌细胞株HeLa的恶性生物学行为相关，说明TFF3在宫颈腺癌发生发展研究中发挥着重要作用，可能为宫颈腺癌诊断与治疗提供一个潜在靶点。

在宫颈癌临床病理特征方面，年龄＜45岁患者TFF3的IOD中位数为2.62×106，明显高于年龄≥45岁患者（1.59×106），二者间存在显著差异（P＜0.05）。说明TFF3的表达水平与宫颈癌患者的年龄相关，年龄越低，TFF3的表达水平越高。其中，小于45岁宫颈腺癌患者28人，鳞癌17人，这符合近年来宫颈腺癌发病年龄年轻化的流行病学特征。在宫颈鳞癌组中，TFF3的表达水平与临床分期、肿瘤直径呈正相关，说明TFF3可能与宫颈癌的进展过程相关。

综上所述，TFF3在宫颈癌的表达水平与组织学类型密切相关，并在一定程度上参与了宫颈癌的恶性进展，全面深入研究TFF3将有助于宫颈癌预后的改善。