LC-MS/MS测定乳粉中高氯酸盐的不确定度影响因素的探讨

朱建新

上海德诺产品检测有限公司， 上海 200436

高氯酸盐是一种化学性质稳定、潜在毒性大的有毒物质，主要用于各种工业和军事应用，包括硝酸盐肥料、固体火箭燃料、弹药、炸药、烟花、道路照明弹和安全气囊[1]。接触高氯酸盐的主要途径是摄入受污染的饮用水或用受污染的水种植的食物[2]。高氯酸盐最终通过食物链进入人体，抑制人体对碘化物甲状腺的摄取[3],持续吸入导致甲状腺功能退化，影响人体发育。高氯酸盐已在多种食物中检测到，包括水果、蔬菜和谷物，以及乳制品和母乳[4]，奶粉中含有高氯酸盐，主要来源可能是在加工过程中使用了含氯的自来水或消毒剂以及包装材料的迁移。目前，加拿大卫生部只规定了“饮用水中高氯酸盐的筛选值为0.004 mg/L (4 μg/L)”[5]。欧盟委员会在2020年5月20日发布(EC)2020/685号条例，补充规定了五类食品的高氯酸盐限量，其中婴儿幼儿配方奶粉、特殊医学用途婴幼儿配方食品为0.01 mg/kg；婴儿食品为0.02 mg/kg；加工谷类食品为0.01 mg/kg[6]。虽然我们国家还未制订食品中的高氯酸盐限量标准, 但监测奶粉中的高氯酸盐含量仍然十分必要。

测量不确定度作为测量结果的一部分，合理表征了被测量量值的分散性，对测量结果的可信性、可比性和可接受性都有重要影响，是评价测量活动质量的重要指标[7]。测量不确定度的大小反映了测量结果的质量高低，不确定度越小，表明测量结果与被测量的真值愈接近，使用价值越高；反之，其使用价值也越低。测量结果的完整性应包括测量不确定度，对不确定度分量进行计算并评定，确定测定乳粉中高氯酸盐的方法中不确定度的主要影响因素，从而为提高检测结果的准确性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈(CH3CN)、甲醇(CH3OH)、甲酸(HCOOH)(色谱纯，默克)；乙酸(CH3COOH)(色谱纯)；甲酸铵(HCOONH4)、乙酸铵(CH3COONH4)(液质联用级)；超纯水(H2O)(电阻率为18.2 MΩ·cm)；高氯钠盐标准品(1 000 μg/mL)；高氯酸盐内标(100 μg/mL，美国剑桥提供，CILOLM-7310-1.2)；PRiMEHLB固相萃取柱(Waters公司)；全脂乳粉。

1.2 仪器与设备

G7120A-G6470B液-质联用仪(安捷伦公司)；涡旋混合器(其林贝尔仪器公司)；匀浆机(Fluko)；离心机(Joucun)；电子天平(METTLER TOLEDO)；恒温水浴振荡器(泰仕特仪器(中国)有限公司)。

1.3 仪器条件

色谱条件：色谱柱：AcclaimTrinity P1离子交换柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相：A为乙腈，B为20 mmol/L乙酸铵溶液；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5.0 μL。质谱条件：离子源：ESI源；检测方式：MRM；扫描方式：负离子模式；毛细管电压：200 V；锥孔压：60 V；溶剂脱温：500 ℃；脱溶剂气流量：1000 L/h；锥孔气流量：150 L/h；用MRM模式采集数据；高氯酸盐定性离子85.0、99.0、101.0，定量离子83.0；内标高氯酸根定性离子107.0，定量离子89.0。

1.4 样品测定

1.4.1称样：称取乳粉试样2 g(精确至0.000 1 g)于50 mL离心管中，加入150 μL内标溶液。

1.4.2提取：上述样品中加入5.0 mL 0.1%乙酸水溶液，迅速混匀，于45 ℃水浴超声20 min，振荡5 min，再加入10.0 mL甲醇，混匀，10 000 r/min离心10 min，吸取上清液，净化。

1.4.3净化：吸取约3.0 mL上述上清液，过固相萃取柱及0.22 μm再生纤维素滤膜，弃去约1 mL流出液，收集续滤液，供上机测定。

1.4.4配制标准曲线：取0.1 mL高氯酸盐标准储备液(1 000 μg/mL)，于100 mL容量瓶中，超纯水定容，制成1.0 μg/mL高氯酸盐使用液。

吸取0 μL、10 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 000 μL高氯酸盐使用液(1.0 μg/mL)，分别加入100 μL高氯酸盐内标溶液(200 ng/mL)，制成的高氯酸盐浓度依次为：0.0 ng/mL、1.00 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、7.5 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、75.0 ng/mL、100.0 ng/mL，标准工作液中高氯酸盐-18O4浓度为2.0 ng/mL。

1.4.5上机测定：在相同试验条件下，分别测定标准溶液和试样，以标准溶液的浓度为横坐标，以内标校正后的响应值为纵坐标绘制标准曲线。按下式(1)计算出试样中高氯酸盐的含量。以试样的两次测定平均值给出结果。

1.5 结果计算

试样中高氯酸盐的含量，按式(1)计算：

(1)

式中：X表示试样中高氯酸盐含量，μg/kg；c表示从标准曲线中读出的试液中高氯酸盐含量，ng/mL；V表示试样溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；f表示试样的稀释倍数；m表示称样质量，g。

计算结果保留三位有效数字。

2 结果与讨论

2.1 测定条件的优化

2.1.1流动相考察

标准流动相：A为乙腈，B为20 mmol/L甲酸铵溶液；改进后流动相：A为乙腈，B为20 mmol/L乙酸铵溶液，其他条件相同。上机后高氯酸盐的出峰时间提前，提高分析效率,高氯酸盐的响应值(从2 906.8变为6 594.2)几乎提高了一倍，详见图1和图2；氯酸盐(RT: 1.030 min)与高氯酸盐(RT: 2.624 min)的分离效果好，能消除测定过程中氯酸盐的干扰，详见图3，故选用20 mmol/L乙酸铵溶液作为B流动相。

图1 标准流动相甲酸铵的高氯酸盐MRM图

图2 标准流动相乙酸铵的高氯酸盐MRM图

图3 氯酸盐和高氯酸盐的TIC图

2.1.2提取液的考察

准确称取2 g乳粉，加入150 μL混合同位素内标液，分别加入5.0 mL 0.1%甲酸水溶液、5.0 mL 0.1%甲酸水溶液、5.0 mL 0.1%乙酸水溶液、5.0 mL 0.1%乙酸水溶液，混匀，水浴超声，涡旋振荡，再分别加入10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈、10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈，经混匀、净化、上机测定，测得样液中高氯酸盐的浓度分别为1.79 ng/mL、1.71 ng/mL、2.48 ng/mL、1.85 ng/mL，说明在相同条件下，5.0 mL 0.1%乙酸水溶液和10.0 mL甲醇，提取效果最好，故选择之。

2.1.3检出限的考察

空白样品(乳粉)中添加50 ng/mL标准高氯酸盐溶液40 μL于2 g空白样品(即加标浓度为1.0 μg/kg)，使用优化后的样品处理方法和流动相，上机测定，测得高氯酸盐的信噪比S/N为39.5、36.4、36.2、27.3、33.3和35.3均≥3，即检出限可降低至1.0 μg/kg，该方法具有较高的灵敏度。

2.2 不确定度来源

根据CNAS-CL01: 2018《检测和校准实验室能力认可准则》要求，实验室应分析和评定测量结果的不确定度。根据GB/T 27418—2017《测量不确定度评定和表示》[8]规范，合成标准不确定度由A类和B类组成。采用A类评定方法的有样品重复性的测定；采用B类评定方法的有标准品的定值、标准曲线的拟合、移液枪、容量瓶、温度波动、电子天平和LC-MS/MS仪器等。

2.2.1不确定度分量评定

2.2.1.1A类标准不确定度uA评定[9]

称取乳粉样品2.013 5 g和2.033 3 g两份，经充分混合均匀、处理后上机测定，测得高氯酸盐含量为23.53 μg/kg、23.68 μg/kg，其平均含量为23.6 μg/kg。

采用贝塞尔公式，单次测量的标准差为：

故高氯酸盐含量测定重复性带入的标准不确定度uA为：

2.2.1.2B类标准不确定度uB评定

(1) 体积的标准不确定度评定uB(V)

uB-3(V)=1.15%

(2) 标准品定值的标准不确定度uB(B)评定

(3) 拟合标准曲线的标准不确定度uB(Q)评定

① 配制六点质量浓度分别为1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL与100 ng/mL的高氯酸盐标准使用液，每个质量浓度平行测量2次，用最小二乘法拟合标准溶液浓度-内标校正后的响应值曲线，标准溶液的测定结果见表1。

表1 高氯酸盐标准溶液测定结果

得出，标准曲线回归方程为：

y=0.334x+0.097 6，r=0.999 95

乳粉样品加标6次后，经测定由标准曲线得到测试液中高氯酸盐的质量浓度分别为0.979 ng/mL、0.938 ng/mL、0.947 ng/mL、0.956 ng/mL、0.966 ng/mL、0.963 ng/mL，其平均质量浓度c为 0.958 ng/mL 。

由拟合标准曲线求c时产生的标准不确定度按下式计算。

式中：SR为从标准曲线求得的内标校正后的响应值Y与相应测得的内标校正后的响应值Yi之差所求出的标准偏差；m为样品溶液的测定总次数，此处m为6；n为标准溶液的测定总次数，此处n为12；c为样品中高氯酸盐质量浓度的平均值；c0为标准溶液中高氯酸盐质量浓度的平均值；ci为标准溶液中高氯酸盐的质量浓度。将数据代入计算公式得出：

② 配制九点高氯酸盐标准浓度，增加7.5 ng/mL、25.0 ng/mL、75.0 ng/mL三个浓度点，经上机测定结果见表2。

表2 三点高氯酸盐标准溶液测定结果

结合1中的六个点的结果得出，标准曲线回归方程为：

y=0.333 8x+0.131 7，r=0.999 95

同样，乳粉样品加标6次经测定后，其平均质量浓度(c)为 0.958 ng/mL。此处m为6；n为18，将数据代入计算公式得出：

由此可见，增加标准溶液浓度点，会降低拟合标准曲线求C时带入的标准不确定度。

(4) 设备的标准不确定度uB(s)评定

② LC-MS/MS带入的标准不确定度uB-2(s)：由LC-MS/MS检定证书可知，取k=2 时，LC-MS/MS的相对扩展不确定度为4%，由此带入的标准不确定度uB-2(s)为：

2.2.2标准不确定度分量汇总

本实验中不确定的来源有A类和B类分量，其数值分布大小，详见表3。

表3 各不确定度分量分布

因此，拟合标准曲线过程中的不确定度是主要影响因素，通过增加标准溶液浓度点可最有效地降低本实验的不确定度。

2.3 加标回收试验

称取乳粉样本，进行3.0 μg/kg、15 μg/kg、75 μg/kg三个水平的加标回收实验(n=6)，其回收率在90.0%～108.0%之间，RSD范围为1.50%～2.39%，结果详见表4。

表4 乳粉中高氯酸盐加标回收试验结果

2.4 其他样品中高氯酸盐的测定结果

通过本方法检测，乳粉中高氯酸盐的含量为23.6 μg/kg。同时，检测了其他类型的食品，结果发现，大多数样品中均有高氯酸盐的检出，其检出的具体数据详见下表5。虽然我国目前还未制订食品中高氯酸盐的限量标准，但根据欧盟委员会在2020年5月20日发布(EC)2020/685号条例，补充规定了五类食品的高氯酸盐限量，部分产品超出了其限值，因此，食品中的高氯酸污染问题应引起有关部门的关注。

表5 其他样品中高氯酸盐的检出数据

3 结论

本文采用LC-MS/MS法测定乳粉中的高氯酸盐含量，经过优化方法，检测结果为23.6 μg/kg，检出限可达到1.0 μg/kg。对称样、样品处理、配制标准溶液、上机测定等各个步骤带入的不确定度分量进行了评定，其中，拟合标准曲线过程中带入的不确定度是最主要的影响因素，当标准溶液浓度为6点时，标准不确定度uB(Q)=0.118；标准溶液浓度为9点时，uB(Q)=0.103。因此，建议在日常检测过程中加强检测人员的技能培训，规范他们的基本操作，通过增加标准溶液浓度点降低标准不确定度，从而提高最终检测结果的准确性。