一株日化产品污染菌及其特性分析

孙廷丽， 杨秀茳， 李彩玲， 李 东， 周少璐， 刘永龙， 谢小保*

1.广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心， 华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室， 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070; 2.广东迪美生物技术有限公司，广州 510663

随着生活水平的提高，人们对于日化产品的要求也不断提高。安全、绿色及多功能等要求，都对日化产品的微生物控制提出了更高的挑战。为满足这些要求，一方面，要严格控制防腐剂的种类及添加量[1-2]，另一方面，越来越多的生物活性物质被应用到日化产品的配方中。这些生物源性的物质如脂类、蛋白质、水溶性聚合物质等，富含微生物生长繁殖所需的营养，使得这些产品特别容易产生微生物的污染。此外，日化产品生产工艺大都比较简单，生产环境也不会进行严格的微生物控制，加上日化产品大多数为反复使用的产品，因此极易产生微生物的污染，从而造成经济损失和对消费者的健康产生影响[3]。因此，充分了解日化产品中污染微生物的特性，丰富日化产品污染菌种资源信息，对该类产品的防腐体系构建及污染治理具有积极的作用。

本文通过对某日化产品厂的污染产品进行分析，确定了污染的优势菌及其群落构成，并对优势菌的耐药性及产品的防腐体系对此类微生物的抵抗力进行了分析，以对此类污染的治理提供理论支持和科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验样品

样品为洗洁精，主要成分包括水、AES、磺酸、片碱、矿物油、盐、香精及防腐剂。防腐剂为卡松，总甲基异噻唑啉酮含量95 mg/kg～100 mg/kg。共选取10个样品，其中5个样品发臭、明显异味或疑似带有异味，另外5个样品为正常样品。所有样品均为同一工厂提供，配方一致，来源于不同生产批次，随机抽样。将上述样品按顺序分别编码为S01～S10。防腐剂样品CJ-5由广东迪美生物技术有限公司提供。

1.2 培养基及试剂

平板计数培养基(PCA)，营养琼脂培养基(NA)，大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)等微生物分析试剂购自广东环凯微生物科技有限公司；DNA提取试剂盒等分子生物学分析试剂购自上海生工生物有限公司；其它生化试剂购自广州化学试剂厂；标准菌种购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.3 仪器设备

生化培养箱、生物安全柜等常规微生物分析设备(广东环凯生物科技有限公司)；高效液相色谱仪(安捷伦)；凝胶成像系统(美国Bio-rad公司)；Nano Drop超微量核酸定量仪(美国 Thermo 公司)；台式高速离心机(湖南湘仪)；琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1微生物菌落总数计数及分离

使用GB4789.2—2016《食品微生物菌落总数的测定》规定的方法测定样品中的微生物菌落总数，并对培养后有菌生长的样品进行单菌落的纯化分离[4]。

1.4.2菌种鉴定及污染样品群落分析

对污染样品的优势菌种使用16SrRNA基因测序的方法进行菌种鉴定，即分别提取污染菌的总DNA，利用细菌的通用引物16sRNAF:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′ 16sRNAR:5 ′-TAGGGTTACCT TGTTACGACTT-3′进行 PCR扩增，扩增条件为:预热95 ℃，5 min;变性94 ℃，50 s，退火54 ℃，40 s，延伸72 ℃，1 min 30 s，共35个循环，72 ℃，10 min。将扩增序列进行测序，结果通过BLAST查找比对分析[5]；选取典型的污染样本进行高通量测序，提取纯化样本DNA后，将验证正确的DNA样本采用Illumina MiSeq/HiSeq测序平台对样本中微生物16SrRNA基因的V3-V4 区(336F-806R)进行测序分析从而得到样本的群落组成及丰度等信息[6-7]。

1.4.3样品中防腐剂含量的测试

参照《化妆品安全技术规范》(2015)中规定的方法，使用高效液相色谱法测试防腐剂的含量[8]，测定结束后，于室温保存28天后，复测防腐剂的含量。

1.4.4菌落耐药性分析

分别测试卡松类防腐剂对污染菌的最低抑菌浓度和使用污染菌种对样品进行防腐挑战试验。具体试验方法如下：最低抑菌浓度测试：参照《消毒技术规范》(2002版)2.1.8.3最小抑菌浓度试验，使用琼脂稀释法测试污染样品分离到的优势菌对防腐剂CJ-5的最低抑菌浓度值[9]。防腐挑战试验：使用ASTM E 640:2019《含水化妆品防腐功效测试》规定的方法，对正常的样品进行防腐挑战试验[10]。测试时，一组样品采用标准规定的大肠埃希氏菌ATCC8739、金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、洋葱伯克霍尔德氏菌ATCC10425、日沟维肠杆菌ATCC33028的混合菌悬液作为挑战菌种，另一组样品使用上述标准菌种与污染菌的混合菌液。测试结束后，对残留的防腐剂含量进行测定。如没有通过防腐挑战实验，则对残留菌种进行菌种鉴定。

2 结果和讨论

2.1 污染样品微生物菌落总数结果

采样后立即对工厂提供的样品进行菌落总数的测定，结果显示，发臭有异味的样品S01～S04，均检出了微生物(细菌)，菌落总数菌超过了106CFU/g。疑似有异味的样品S05及正常无异味的样品S06～S10，菌落总数均<10 CFU/g。对所有未检出微生物的样品，经室温自然存放28 d后进行复测，S05异味明显，菌落总数达到1.9×104CFU/g；S06～S10性状气味无改变，存放后仍未检出微生物。这表明样品的变质主要是由微生物污染引起。具体结果见表1。

2.2 变质样品中微生物的优势菌种及群落构成

对污染样品进行常规培养后，分离培养得到优势菌种，并使用16S rRNA基因测序的方法对其进行了鉴定。对5个样品的测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果均为类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoaligenes)，序列相似度均超过99%，具体结果见表2。使用高通量测序分析样品的细菌群落构成，在属水平上，5个污染样品中共注释到了26个类群，其中假单胞菌属为所有样品中共有的属，且其序列数比例均超过50%；除此之外，苍白杆菌属在S01、S02中占比较高，分别为19.9%及25.4%，为第二优势属；而柄杆菌属、青桔菌属及葡萄球菌属则是S05中除假单胞菌属外的其它优势属，其占比分别为17.6%、20.3%及7.3%。在种水平上，5个样品共注释到23个类群，类产碱假单胞菌为所有样品中的优势种。其中S03、S04样品的菌种构成比较单一，类产碱假单胞菌的丰度达到99.9%；S01、S02的群落构成基本相似，但各菌种丰度略有不同，其组成均为类产碱假单胞菌(丰度分别为77.49%及77.43%)、未能分类菌种(Unclassified，分别占19.88%及25.40%)及少量汉氏盐单胞菌(Halomonasstevensii)(小于2%)；S05的组成最为复杂，其中类产碱假单胞菌占53.59%、其独有的优势菌分别包括未能鉴定到种的海洋浮游菌(unidentified marine bacterioplankton)20.32%、柄杆菌(Caulobactersp.)17.63%及路邓葡萄球菌(Staphylococcuslentus)7.33%。上述微生物属水平及种水平群落构成分别见图1和图2。由上述结果可以推定，发生污染的样品中，污染的主要来源是一致的，但不排除其它污染渠道的存在，污染样品中可能存在其它常规培养中未能培养的微生物，或者这些微生物含量较低，不足以形成生长优势。

表2 微生物菌种鉴定结果及丰度分布信息

图1 属水平物种相对丰度

图2 种水平物种相对丰度

2.3 样品中防腐剂含量的测定结果

采样后，对样品中的防腐剂含量进行测试，结果见表3。结果显示，5个微生物污染样品中，所有样品的防腐剂含量均有所下降，其中S01、S03样品防腐剂含量已降至不能检出，S02、S04、S05样品的总甲基异噻唑啉酮含量分别是 59.9 mg/kg、 46.6 mg/kg和 85.9 mg/kg。对上述样品自然放置28 d后复测防腐剂含量，其总异噻唑啉酮含量均下降至未检出。这表明，样品的腐败菌有一定的耐药性，且会持续的消耗防腐剂。对正常未检出微生物的样品也进行防腐剂含量的检测，其总异噻唑啉酮的含量分别为103.7 mg/kg、88.2 mg/kg、88.3 mg/kg、76.5 mg/kg和71.1 mg/kg。该配方产品中，正常生产的防腐剂理论添加量为 95 mg/kg ～100 mg/kg，S06～S08的防腐剂含量在正常允许偏差内，而S09～S10则略有降低。复测S06～S10的防腐剂含量，发现其基本不变。这说明，未发生微生物污染的样品中，防腐剂的含量基本没有降低，未发生大量的消耗。结合优势菌的鉴定结果，推测认为，引发污染的产碱假单胞菌消耗或降解了体系中的防腐剂，或通过代谢改变了体系的微环境，从而造成了变质样品中防腐剂含量持续降低的现象。

表3 样品中残留防腐剂的含量

2.4 污染菌的耐药性分析及对防腐体系的挑战实验结果

2.4.1污染菌的最低抑菌浓度结果及分析

污染菌及标准菌的最低抑菌浓度测试结果见表4。测试数据显示，来源于污染样品的污染菌的最低抑菌浓度低于污染样品体系中的防腐剂含量，说明污染菌对变质样品体系中的防腐剂产生了一定的耐药性，可以在较高浓度的防腐剂含量下生长。但这种耐药性并不会随着传代而传递，在防腐剂的选择压力消失时，其耐药性消失，表明该腐败菌的耐药性不是由基因突变产生的稳定耐药，而是由于基因表达调控或代谢调控等引起的群体适应性引起的。这样的发现，对于进一步的微生物污染治理具有积极的参考价值。

表4 污染菌及标准菌的最低抑菌浓度测试结果

2.4.2防腐挑战试验结果

仅采用标准菌和采用标准菌加污染菌的混合菌液作为挑战菌种分别进行防腐挑战试验，其结果见表5。结果显示，对同一配方的正常产品进行防腐挑战试验，使用标准混合菌作为挑战菌种时，接种后3 d微生物即下降至不能检出；使用标准混合菌加污染菌种作为挑战菌种时，则仅有一个样品可以通过挑战。对其28 d挑战结束后的残留菌种及防腐剂含量进行测试，未能通过挑战实验的样品中，残留菌均为铜绿假单胞菌，且未通过挑战的样品28 d后已经没有防腐剂残留，表明未通过挑战的结果非实验室操作污染引起，挑战结果可靠。标准混合菌均能够通过挑战测试，并且防腐剂残留量无异常。结合前文中污染样品中防腐剂全部无残留，及本次防腐挑战前后样品的防腐剂含量变化，可以发现，在含有类产碱假单胞菌的样品下，防腐剂的含量均出现了大幅的下降，而不含此菌株的体系，防腐剂的含量则没有明显的降低。由此可以推测，分离到的污染菌是引起防腐剂含量降低的主要因素。该菌种具有一定的耐药性，但耐药性并不能持续传递，当防腐体系中的防腐剂被消耗降解至一定浓度时，由于防腐挑战菌种之间的生存竞争，污染菌本身未能占据生长优势，导致挑战之后的存活菌种为铜绿假单胞菌。该结果进一步说明腐败菌具有一定的非典型性。

表5 防腐挑战试验结果

3 结论

本研究表明，引起本次日化产品变质的主要原因是微生物污染，其主要污染微生物为类产碱假单胞菌。这类微生物是一种革兰氏阴性、好氧的环境微生物，可以从石油[11]、海洋样本[12]、切削液[13]、重金属废水[14]、医院病人样本[15-16]及其它环境[17]等中分离得到，日化污染中的报道少见。此类细菌对环境具有广泛的适应性，可以在有重金属、高渗透压或某些有机杀菌剂存在的情况下存活并产生耐药性。报道显示，从上述环境中分离到的类产碱假单胞菌，有些可以改变应激反应机制，通过提高离子通道通透性、脯氨酸、抗氧化酶等的含量来提高植物对高盐环境或干旱环境的耐受性[18-20]，有些通过差异化表达某些基因，调节蛋白及酶的水平来实现对金属富集环境的适应[21-24]。OLAYA-ABRIL A等发现，在珠宝废水中的类产碱假单胞菌可以过量产生二氢二癸酸合酶DapA1。这是一种参与赖氨酸代谢的蛋白质，也参与二癸酸盐的合成，而二癸酸盐是优良的金属螯合剂，可以提高铁、铜、锌等金属的耐受能力[22]。此外还发现，类产碱假单胞菌可以利用多种氮源及碳源，如石油烃[11,25]、硝基苯[26]、硝酸盐及亚硝酸盐[27]，及其它物质[13,17]，一株可以降解氰化物的类产碱假单胞菌在以含氰化物的首饰残渣及铵分别作为唯一氮源时，共有20个sRNAS发生了差异化表达，这些基因大多与编码氰化物同化所必需的硝化酶NitC的nit1C基因簇、编码氰化物不敏感的细胞色素bd型末端氧化酶的cioAB基因簇、中等长度的聚羟基脂肪酸盐(ml-PHAs)基因簇、编码谷氨酰胺合成酶和尿素酶的基因簇相关[23]。同时这类菌株还具有一定的致病性，并发现其对某些抗生素有一定的耐药性[28-29]。本次污染中分离到的腐败菌可以持续引起异噻唑啉酮类消毒剂的降解或消耗，对此类消毒剂有一定的耐受性。由于其耐药性没有实现持续的传递，初步推测不是由基因突变导致的，这种对防腐剂的耐受性，可能是由于能降解这种防腐剂的酶的基因表达或翻译水平发生了调控；也可能是污染菌的代谢途径发生了改变，使得体系的微环境发生了改变，从而引起甲基异噻唑啉酮类防腐剂降解，或者是其它的未知的途径改变等引起的获得性耐药。使用这种腐败菌种混合标准菌进行防腐挑战实验时，比较难以通过挑战测试，但是最终体系中残留的菌种却不是这种污染菌，进一步表明了这个菌种的特殊性。由于尚没有关于这种微生物对卡松类防腐剂耐药性的深入报道，其耐药机理其耐药机理值得进一步的研究和探讨。

近年来，随着法律法规的不断完善，允许使用的防腐剂类别逐年受限，导致产品保护的压力越来越大[30-31]。逐年缩紧的使用谱和不断增加的防腐剂添加量，进一步导致了耐药菌的产生，从而形成恶性循环[32]。因此，建立工业产品的污染菌种数据库，通过对工业产品中的腐败微生物的分离鉴定，充分了解其生物学特性及耐药特征，有助于制定出更合理有效的微生物控制方案。除了常见的污染微生物，非常规、不典型的菌种也应该引起充分的重视，这对于科学的进行日化产品生产、运输、存储及使用过程的微生物控制具有积极的意义。