猪瘟病毒的基因组学及诊断技术

文│史艳华（辽宁省法库县农业技术推广与行政执法中心）

猪瘟是由ASFV感染引起的一种可致猪类动物极高死亡率的疾病，其本质是动物瘟疫，也是国家联合卫生组织在通过了卫生法研究后，通报的一类疫病。猪瘟病毒在分子结构上是一种呈现双螺旋结构的DNA序列病毒，可以通过蜱虫进行血液传播与感染。在20世纪20年代，此类病毒首次在非洲被发现，并在50年代传播到各国。直到1990年，各个国家正式认识到了此病毒对于人类社会发展与动物生存的威胁，提出了针对此类病毒的防控手段与措施。

随着防疫手段的不断创新与升级，猪瘟病毒已基本在各个国家内消除，直到2007年，猪瘟病毒再次在各个国家内呈现，并出现了高速繁殖的趋势。在我国辽宁沈阳地区，2018年遭受了猪瘟病毒的侵害，动物大量死亡，不仅对该地区当时经济建设造成了较大的影响，同时也感染到了人体。猪瘟病毒在临床上的主要表现为高烧、发热、呕吐、腹泻、厌食等现象。经过了一段时间的研究，仍未能及时产出有效治疗或切断病毒的疫苗。因此，要解决猪瘟病毒对人类造成的威胁，需要做好猪瘟病毒的诊断工作，及时发现存在异变的猪瘟病毒基因序列，将病毒对人体造成的损伤降至最低。为了落实此项工作，笔者将开展猪瘟病毒基因组学的分析，根据其基因序列，提出一种全新的诊断技术，做到对病毒的高效防治。

一、猪瘟病毒的基因组学及诊断技术

1.猪瘟病毒的基因组序列分析。猪瘟是危害我国养猪业发展的主要疫病之一，为了实现对此类病毒传输的切断，需要在开展诊断技术设计与研究前，进行猪瘟病毒基因组学的分析。在此过程中，引进CSFV软件，进行毒株基因组序列的分析，提取Brescia毒株与Alfort毒株，使用相同的方式，在软件中进行毒株基因组的分析，分析后发现基因组测试结果分别为12589bp与12604bp，对应毒株的氨基酸序列同源性高达95%。由此可以证明，多种类型的猪瘟病毒基因组序列是相近的。

在深入对猪瘟病毒基因组序列的分析中发现，大部分基因组呈现单股、正链结构，具有较强的感染性，基因组在动物体内的沉降系数在35S～55S之间，分子量约为4×106单位，序列长度大约为12.1Kb，由5个非编码区域、1个ORF区域、3个序列区域构成。基因组序列示意图如下图1所示。按照图1所示的结构，即可实现对其他类型猪瘟病毒基因组序列图的绘制。综上所述，完成对猪瘟病毒的基因组序列分析。

2.提取猪瘟病毒基因组蛋白结构。完成对猪瘟病毒的基因组序列分析后，提取猪瘟病毒基因组蛋白结构，进行CSFV病毒的初步诊断。在此过程中应明确CSFV病毒中的ORF基因可实现对多个氨基酸蛋白的有效编码，在完成编码后，进行蛋白结构的解译，并同步进行蛋白宿主细胞中毒酶的加工，通过此种方式，便可以实现对结构蛋白的生成。提取结构蛋白中以非结构方式呈现的蛋白，将其作为CSFV病毒基因组蛋白结构。

3.猪瘟病毒基因组RNA的荧光检测与诊断。完成对基因组蛋白结构的提取后，采用荧光测试的方式，对猪瘟病毒基因组RNA进行检测与诊断。荧光测试属于一种自然光发光测试反应，测试中，将所选的毒株放置在培养器皿中，荧光素酶与毒株中的ATP发生化学反应，辅助使用光照仪器进行荧光效果分析，即可实现猪瘟病毒的有效诊断。

测试中，使用荧光显微镜锁定毒株中的基因序列，提取蛋白结构，对其进行RNA检测。为了提高检测结果的精度，可在测试中辅助搭配CCD软件测定。在此基础上，使用共聚焦设备，对逐步测定结果进行光学层切处理，得到针对猪瘟病毒基因组RNA的三维定位信息。设定多个荧光检测通路，选择Timelaps进行定时取图，此种设备在实际应用中具有较强的分辨率，可以提高检测结果的精度与真实度。使用全内反射仪器，对毒株细胞进行膜内测试，将测试结果进行终端成像。使用双光子设备，进行长波激发荧光显色，此设备在实际应用中可以实现对活体组织细胞中病毒分子结构与基因组结构的测定，测定结果可以突破100微米的极限。

完成荧光检测的相关工作后，等待培养皿中测试样本的显色程度，在完成完全显色后，培养皿局部出现荧光显色，可以提取局部组织按照上述步骤进行二次荧光测试。对于测试区域内80以上的显色行为，即可直接得出诊断结果。通过此种方式不断迭代处理，完成猪瘟病毒基因组RNA的荧光检测，实现对猪瘟病毒的基因组学诊断技术的设计研究。

二、诊断技术应用效果

为了证明本文设计的猪瘟病毒诊断技术在实际应用中具有较强的优势，下述将通过实例应用与对比分析的方式，对设计的技术进行实践检验。在此过程中，选择某地区病毒防疫站作为实验场所，由该防疫站内的专业技术人员参与此次诊断技术实验检测工作。为了保证实验过程的安全性，避免实验中所使用的病毒外泄，扰乱社会发展秩序，需要在防疫单位内搭建一个相对封闭的实验场所，所有在场参与实验的技术人员与工作人员需要穿着防护服进入实验场所。完成实验中的准备工作后，进行病毒血清与毒株的制备。选择K-15第80代细胞毒株作为实验样品，此样品在通过了国家卫生监督检查防疫站认证后，在中国兽医类药品监察机构购买。在此基础上，进行猪瘟病毒在实验室内的繁殖与培养。培养过程中，将购买的毒株样品细胞放置在培养器皿上，按照表1预设的实验环境，进行实验样品的制备。

按照上述方式，进行实验环境的布置，将细胞放置在上述环境中培养24小时，确保单层细胞覆盖率达到85%以上时，使用专业的仪器设备，进行猪瘟病毒的提取。使用设计的诊断技术，对实验样本进行荧光测试，测试时长为15分钟，荧光测试结果如图2所示。

从上述图2可以看出，荧光测试在5分钟时，培养皿测试区域初步反应显色；荧光测试在10分钟时，培养皿测试区域显色已较为明显；荧光测试在15分钟时，培养皿测试区域已完全显示。由此可以证明设计的猪瘟病毒诊断技术具有对病毒的有效诊断效果。

完成上述实验后，选择基于CHO-K1技术的诊断技术作为传统技术，对制备的样本进行诊断与病毒检测，记录不同样本的显色时间，将培养皿测试样本完全显色作为指标，记录从诊断开始到诊断结束，两种不同诊断技术所需要的时长。将结果整理成表格，如表2所示。

从表2所示的实验结果可以看出，技术诊断耗时小于传统技术诊断耗时，证明在相同条件下，本文设计的诊断技术在实际应用中具有更高的诊断效率。综上所述，得出此次对比实验的结论：相比基于CHO-K1技术的诊断方法，笔者设计的猪瘟病毒诊断技术在实际应用中，可以有效缩短诊断耗时，将诊断所需时长控制在15分钟范围内。

三、结语

表1 猪瘟病毒实验样品制备环境与制备条件

表2 猪瘟病毒诊断技术耗时对比

笔者从猪瘟病毒的基因组序列分析、提取猪瘟病毒基因组蛋白结构、猪瘟病毒基因组RNA的荧光检测与诊断三个方面，完成了猪瘟病毒的基因组学及诊断技术的研究。并选择基于CHO-K1技术的诊断技术作为传统技术，开展对比实验研究，通过对比实验证明，设计的猪瘟病毒诊断技术在实际应用中，可以有效缩短诊断耗时，将诊断所需时长控制在15分钟范围内。因此，可在后续的研究中，尝试将设计的方法代替传统的方法在临床中使用，以此种方式解决我国动物产业在发展与建设中受到瘟疫干扰与抑制的问题。但要正式将此项技术广泛推广在市场，还需要对此方法进行多次实验，从不同层面证明此项诊断的可行性。