外泌体中circ-RPPH1通过circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19通路轴调控乳腺癌对紫杉醇的耐药性

赵玥， 付永强， 周真林， 杨明， 黄维超， 方雅兰

据世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC)发布的全球癌症负担数据显示，2020年全球乳腺癌新发病例高达226万例，成为全球第一大癌症[1]。手术、放疗、化疗、靶向治疗是乳腺癌的主要治疗手段[2]，其中化疗在乳腺癌综合治疗中占有不可替代的地位，但是几乎不可避免的化疗耐药一直是限制乳腺癌治疗的瓶颈[3]。近年来研究发现，乳腺癌耐药与乳腺癌患者复发及转移紧密相关，耐药乳腺癌更易发生远处转移，而转移的乳腺癌更具药物耐受性[4]，这也成为乳腺癌治疗过程中的主要障碍和难题。

外泌体可以参与肿瘤及肿瘤耐药的调节[5]，外泌体是细胞分泌的纳米级膜微粒，它是包含了复杂RNA、蛋白质、细胞因子、转录因子受体等活性物质的小膜泡(30～150 nm)[6]。机体的多种细胞均可分泌外泌体，其广泛分布于唾液、血浆、乳汁等体液中。外泌体可以参与细胞间通讯，是转移物质及信息蛋白质、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)的优良中介，而不需要直接的细胞间接触[7]。研究表明，肿瘤细胞和肿瘤微环境中的基质细胞均可分泌携带有耐药相关分子的外泌体，并通过外泌体在肿瘤微环境中相互作用，从而调节肿瘤细胞对药物的耐受性[8]。

环状RNA(circRNA)是具有环形结构的内源性非编码RNA，它通过外显子环化或内含子环化将3′和5′末端连接起来，形成完整的环形结构[9]。circRNA可通过充当miRNA海绵，或是与蛋白质相结合，从而参与基因表达调控并影响蛋白质的功能。有研究发现circRNA与肿瘤存在紧密关联[10]。其高度稳定性和特异性使之有望成为肿瘤潜在的预测及治疗靶点[11]。本研究通过研究外泌体中circ-RPPH1对乳腺癌耐药细胞生物学功能的影响，以期探究circ-RPPH1在乳腺癌耐药中的分子调节机制。

1 资料与方法

1.1 生物信息数据检索

检索高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)，分析乳腺癌患者肿瘤组织与正常组织间差异表达的circRNA，通过circular RNA interactome数据库预测目标circRNA的靶向miRNA，通过TargetScan数据库预测靶向miRNA的下游靶向关系。

1.2 病例资料

收集2020年2月至2021年10月遵义医科大学附属贵航三OO医院诊治的53例乳腺癌患者，均经病理学证实，均使用紫杉醇行新辅助化疗，依据化疗过程中肿瘤体积的变化程度进行分类：肿瘤体积缩小为紫杉醇敏感组(24例)，肿瘤体积不变或进展为紫杉醇耐药组(29例)；另选择同期我院收治的非乳腺癌患者(33例)作为正常组。取3组患者的血清学样本及手术切除组织样本，存放于液氮中，冷冻过夜后再转移至-80 ℃低温冰箱中保存。

1.3 主要细胞和试剂

乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A均购自美国ATCC公司。MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX细胞、小干扰RNA(siRNA)和慢病毒均由泰安华启生物科技有限公司构建。全外泌体纯化试剂(Total Exosome Isolation Reagent)购自美国Thermo公司。miRNA分离试剂盒(miRNA Isolation Kit)、TRIzol RNA试剂盒购自美国Invitrogen公司。多合一miRNA RT-qPCR检测试剂盒购自美国GeneCopoeia公司。反转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)购自日本Toyobo公司。荧光素酶活性检测试剂盒、Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒、Imax转染试剂及MTT试剂盒购自英国Abcam公司。黏蛋白19(MUC19)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国MyBioSource公司。RIPA缓冲液、超敏ECL化学发光试剂盒和蛋白质定量试剂盒均购自南京维诺赞公司。Transwell小室购自美国Corning公司。10只BALB/c-nu型裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19筛选

通过GEO数据库分析乳腺癌患者肿瘤组织与正常组织差异表达的circRNA，借助circRNA表达谱热图分析筛选出circ-RPPH1；通过circular RNA interactome数据库预测circ-RPPH1靶向miRNA的为miR-146b-3p；通过TargetScan数据库预测靶向miR-146b-3p的下游靶向为MUC19。

1.4.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ-RPPH1和miR-146b-3p表达水平 于53例乳腺癌患者中随机选取33例作为乳腺癌组，分别取乳腺癌组与正常组、紫杉醇敏感组与耐药组患者血清，应用TRIzol RNA试剂盒分别提取细胞RNA，将RNA反转录生成cDNA，以GAPDH为内参，使用SYBR Green Ⅰ进行RT-qPCR检测各组血清circ-RPPH1表达水平。使用miRNA分离试剂盒分离miR-146b-3p，miRNA RT-qPCR 检测试剂盒反转录miR-146b-3p，TRIzol RNA试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，以U6为内参，qRT-PCR检测miR-146b-3p表达情况，以2-ΔΔCt计算其表达水平。circ-RPPH1正向引物：5′-TTGGGAAGGTCTGAGACTAGGG-3′;反向引物5′-CCACTGATGAGCTTCCCTCC-3′。GAPDH正向引物：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′;反向引物：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。miR-146b-3p正向引物：5′-TGAGAACTGAATTCCATAGGCT-3′;反向引物：5′-GCACTGTCAGACCGAGACAAG-3′。U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3′;反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC3′。

1.4.3 ELISA测定MUC19水平 使用MUC19 ELISA试剂盒按照说明书操作，测定450 nm波长处的吸光度值，记录MUC19浓度。

1.4.4 外泌体分离 使用全外泌体纯化试剂盒，选取状态较好的乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX细胞，培养48 h后，加入新鲜的不含外泌体血清的细胞培养基，继续培养24 h，收集20 ml细胞培养液，4 ℃、300 ×g离心30 min，取上清液，经0.22 μm滤过膜过滤后，加入50 kd超滤管中，4 ℃、4 000 ×g离心10 min，吸取2 ml浓缩细胞培养液至新的离心管中，加入1 ml外泌体提取试剂，混匀后4 ℃过夜，4 ℃、10 000 ×g离心1 h，弃上清液，用200 μl PBS重悬沉淀，用于后续鉴定分析。

1.4.5 外泌体鉴定 用透射电镜观察外泌体形态：取20 μl外泌体悬液，均匀涂布在电镜铜网上，室温放置10 min；用滤纸吸干液体，然后用30 μl磷钨酸(20 mg/ml)对外泌体样品室温负染1 min，滤纸吸干液体后，放于烤灯下烤干，安装铜网于样品槽中，在透射电镜下观察外泌体的形态并拍照；采用Western blotting法检测外泌体标志蛋白，将提取的细胞外泌体蛋白经BCA法蛋白定量后，取20 μg样品，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭，PBS洗涤，将膜与CD63、CD9、CD81及TSG101一抗孵育，4 ℃过夜，然后与二抗孵育 1 h，与ECL试剂温育后分析印迹。

1.4.6 外泌体摄取实验 取耐药细胞外泌体200 μl，与1 ml细胞膜荧光标志试剂(PKH67)混匀，室温孵育5 min后，加入2 ml BSA(0.5%)结合过量的PKH67终止染色，然后使用外泌体沉淀液沉淀出PHK67标记的外泌体，用9.6 ml基础培养基重悬沉淀；取250 μl PKH67标记的外泌体，与乳腺癌细胞在37 ℃共孵育3 h，PBS清洗细胞后，室温固定1 h，DAPI染色10 min，利用荧光显微镜观察外泌体摄入情况。

1.4.7 circ-RPPH1外结构验证 将紫杉醇耐药乳腺癌细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX分为3组，不加入试剂者为对照组，加入核酸内切酶(RNaseA)者为RNaseA组，加入核酸内切酶+去垢剂(RNaseA+Trition X100)者为RNaseA+Trition X100组，检测每组细胞中的circ-RPPH1含量。

1.4.8 紫杉醇耐药性检测 以半数抑制浓度(IC50)表示细胞系对紫杉醇的耐药性，用GraphPad Prism7软件计算乳腺癌细胞系、乳腺癌耐药细胞系及敲低circ-RPPH1表达后乳腺癌耐药细胞系的IC50值。

1.4.9 细胞培养 将紫杉醇耐药乳腺癌细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX培养于含有10%胎牛血清及0.1%的双抗青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中。然后置于37 ℃含5%CO2的恒温恒湿培养箱中进行培养，根据细胞的情况更换新鲜的培养基。待细胞融合度达80%左右进行传代培养。

1.4.10 siRNA转染 待细胞融合度达30%～50%，加入5 μl siRNA转染，培养24 h后，收集细胞并提取RNA，作为si-circ-RPPH1组，以空白质粒(si-NC)作参照为si-NC组，使用RT-qPCR法检测各组circRNA的量。siRNA正向引物：5′-CGGGGAGGGAAGCUCAUCATT-3′；反向引物：5′-UGAUGAGCUUCCCUCCCCGTT-3′。

1.4.11 细胞增殖实验 将细胞以合适的密度接种于96孔培养板中，分别选取培养不同时间的细胞进行增殖能力测定。分别向每个细胞孔中加入20 μl MTT溶液(5 μg/ml)，孵育4 h。轻轻吸取上层培养基后，向每孔中加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，以充分溶解结晶物，于490 nm波长处测定吸光度值，为了便于统计分析，将吸光度值乘以100倍。

1.4.12 细胞迁移及侵袭实验 ①迁移实验：用2 ml含1%FBS的新鲜培养基重悬细胞，将细胞接种于12孔板中，于37 ℃培养箱中培养24 h，取出Transwell小室，用PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定，于4 ℃冰箱中固定30 min，经PBS清洗后以结晶紫染色20 min，在显微镜下拍照3个视野，计数其细胞数并取其平均数。②侵袭实验：基质胶4 ℃过夜融化后，用无血清培养基稀释至1 mg/ml，取100 μl稀释后，将基质胶加入Transwell上室，于37 ℃培育4 h使之形成胶状，后续步骤同迁移实验。

1.4.13 克隆形成实验 将细胞消化重悬后计数，以1 000个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将细胞放入培养箱孵育2周，用结晶紫染色30 min，PBS冲洗3次，统计克隆形成数。

1.4.14 流式细胞仪检测细胞周期 将细胞接种于6孔板，浓度调整为2×106/ml，于37 ℃培养48 h，根据细胞周期检测试剂盒说明书加入试剂处理细胞，置于流式细胞仪中检测细胞周期。

1.4.15 RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) 收集细胞，用磁珠和抗Ago2抗体孵育24 h后，洗涤后用蛋白酶K消化蛋白，依次用酚-氯仿-异戊醇试剂纯化RNA，用RT-qPCR检测RNA，以IgG作为阴性对照。用3′-生物素化miRNA模拟物转染细胞，然后裂解细胞并与链霉抗生物素蛋白偶联珠孵育，形成生物素-miRNA-circRNA复合物，用蛋白酶K消化后，用RT-qPCR检测circRNA含量，以此证实miRNA与circRNA结合。

1.4.16 双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性 根据circ-RPPH1、miRNA和mRNA结合位点，利用软件设计对应引物，并构建野生型、突变型circ-RPPH1荧光素酶载体，收集各组转染48 h的细胞，用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶的活性。

1.4.17 裸鼠移植瘤模型体内肿瘤生长情况及其与circ-RPPH1的关系 于裸鼠背部右侧皮下注射稳转circ-RPPH1的细胞，构建裸鼠移植肿瘤模型，实验分为2组：空白对照组(sh-NC组)、质粒包裹的circ-RPPH1组(sh-circ-RPPH1组)，每组各3例，每3天测一次裸鼠的肿瘤体积，待肿瘤生长到一定体积，取出肿瘤，测定小鼠肿瘤的体积及质量，绘制肿瘤生长曲线，同时检测circ-RPPH1的表达情况。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 circ-RPPH1在乳腺癌组织与正常组织中的表达情况

circRNA表达谱热图及GEO数据分析circ-RPPH1表达图谱结果显示，circ-RPPH1在乳腺癌患者与正常组织中存在差异化表达，见图1。

图1 circ-RPPH1在乳腺癌组织与正常组织中存在差异化表达

2.2 乳腺癌与非乳腺癌患者血清中circ-RPPH1的表达水平比较

乳腺癌组血清中的circ-RPPH1表达水平高于正常组(3.16±0.79vs.1.30±0.51，t=11.421，P<0.001)；紫杉醇耐药组患者血清中的circ-RPPH1表达水平高于紫杉醇敏感组(9.27±1.22vs.2.73±0.84，t=23.062，P<0.001)，见图2。

图2 乳腺癌与非乳腺癌患者血清中circ-RPPH1的表达水平比较

2.3 circ-RPPH1在乳腺癌细胞系及紫杉醇耐药乳腺癌细胞系中的表达水平

乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表达水平为(1.89±0.15)、(2.56±0.25)，均高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A中circ-RPPH1的表达水平(1.00±0.08)，差异有统计学意义(t=8.810、10.163，P<0.001)。紫杉醇耐药乳腺癌细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中circ-RPPH1的表达水平为(3.69±0.35)、(5.32±0.55)，均高于乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表达水平(t=8.187、7.902，P<0.001，图3)。

图3 circ-RPPH1在正常乳腺上皮细胞、乳腺癌细胞系及紫杉醇耐药乳腺癌细胞系中的表达水平比较

2.4 circ-RPPH1在乳腺癌紫杉醇耐药组和紫杉醇敏感组患者血清外泌体中的表达水平

乳腺癌紫杉醇耐药组患者血清外泌体中的circ-RPPH1水平高于乳腺癌紫杉醇敏感组(11.23±1.37vs.3.93±0.86)，差异有统计学意义(t=7.886，P<0.001)。

2.5 外泌体观察和鉴定

透射电镜扫描可见，乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX细胞中的外泌体均表现为典型的直径60～100 nm的囊泡状结构；且血清及细胞外泌体中均表达CD63、CD9、CD81和TSG101，上清液中则无此4种标志蛋白表达，见图4。

图4 外泌体照片及外泌体免疫印迹检测结果

2.6 乳腺癌耐药细胞中circ-RPPH1含量比较

在紫杉醇乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中，RNaseA+Trition X100组的circ-RPPH1含量为(0.36±0.05)、(0.20±0.04)，均低于RNaseA组的circ-RPPH1含量(分别为0.90±0.12、0.95±0.09)，差异有统计学意义(t=10.767、12.865，P<0.001，图5)。

图5 对照组、RNaseA组、RNaseA+Trition X100组中circ-RPPH1含量比较

2.7 外泌体负责转运circ-RPPH1并影响乳腺癌细胞的耐药能力

外泌体摄取实验中，乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231摄取乳腺癌耐药细胞外泌体后circ-RPPH1的表达水平为(2.60±0.25)、(3.90±0.33)，均高于PBS处理组中circ-RPPH1的表达水平(1.00±0.12、1.00±0.15)，差异有统计学意义(t=9.993、13.857，P<0.001，图6A)。

敲低乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表达后，circ-RPPH1的表达量为(1.45±0.15)、(1.75±0.17)，低于si-NC组circ-RPPH1的表达量(2.60±0.25)、(4.00±0.40)，差异有统计学意义(t=6.832、8.967，P<0.001，图6B)；乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231对紫杉醇的IC50为(24.30±2.40)nmol/L、(18.30±1.80)nmol/L，低于si-NC组的IC50为(40.00±3.20)nmol/L、(31.00±2.20)nmol/L，差异有统计学意义(t=6.798、7.739，P<0.001，图6C)。

6A：共孵化后乳腺癌细胞系摄取circ-RPPH1水平；6B：敲低circ-RPPH1后乳腺癌细胞系中circ-RPPH1表达水平；6C：敲低circ-RPPH1后乳腺癌细胞系对紫杉醇耐药能力的影响图6 外泌体负责转运circ-RPPH1并影响乳腺癌细胞的耐药能力

2.8 外泌体中circ-RPPH1调控乳腺癌耐药细胞系对紫杉醇的耐药能力

乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX对PTX耐药性的IC50为(193.0±10.8)nmol/L、(132.0±12.3)nmol/L，分别高于乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231对PTX的IC50(21.2±1.8)nmol/L、(14.5±1.2)nmol/L，差异有统计学意义(t=27.1178、16.468，P<0.001，图7)。敲低乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中circ-RPPH1的表达后，circ-RPPH1的表达水平为(0.30±0.04)、(0.36±0.06)，低于si-NC组(1.02±0.15、1.00±0.09)，差异有统计学意义(t=8.033、10.248，P<0.001，图8A)；乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX对紫杉醇的IC50为(89.0±8.0)nmol/L、(72.0±7.0)nmol/L，分别低于si-NC组(182.0±14.0)nmol/L、(131.0±14.0)nmol/L，差异有统计学意义(t=9.990、6.999，P<0.001，图8B)。

图7 乳腺癌细胞系及耐药细胞系对紫杉醇的耐药性

8A：敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐药细胞系中circ-RPPH1的表达；8B：敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐药细胞系对紫杉醇的耐药情况图8 circ-RPPH1调控乳腺癌耐药细胞系对紫杉醇的耐药能力

2.9 敲低乳腺癌耐药细胞系中circ-RPPH1表达后乳腺癌耐药细胞增殖、迁移及侵袭能力变化

敲低乳腺癌耐药细胞系中circ-RPPH1的表达后，增殖实验中乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX在490 nm波长处的吸光度值分别为(33.0±3.0)、(42.0±4.0)，低于Si-NC组的吸光度值(95.0±8.0、110.0±12.0)，差异有统计学意义(t=12.569、9.311，P<0.001，图9)。迁移实验中乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX细胞计数为(55.0±5.0)个、(63.0±6.0)个，低于Si-NC组细胞计数(105.0±9.0)个、(159.0±13.0)个，差异有统计学意义(t=8.412、11.613，P<0.001，图10)。侵袭实验中乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX细胞计数为(52.0±5.0)个、(68.0±6.0)个，低于Si-NC组细胞计数(110.0±10.0)个、(147.0±12.0)个，差异有统计学意义(t=8.985、10.199，P<0.001，图11)。

图9 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐药细胞系增殖情况

图10 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐药细胞系迁移情况

图11 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐药细胞系侵袭情况

2.10 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐药细胞株细胞周期的变化

敲低circ-RPPH1的表达后，乳腺癌耐药细胞系细胞DNA合成受阻，细胞阻滞于S期，见图12、表1。

图12 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐药细胞系细胞周期

表1 敲低circ-RPPH1表达后乳腺癌耐药细胞系细胞周期变化

2.11 circ-RPPH1与miR-146b-3p之间存在靶向调控关系

经circular RNA interactome数据库检测circ-RPPH1直接关联的miRNAs，预测circ-RPPH1与miR-146b-3p之间具有靶向关系，见图13。双荧光素酶报告系统检测，野生型circ-RPPH1与miR-146b-3p结合后荧光数减少，提示野生型circ-RPPH1与miR-146b-3p结合且结合后下调miR-146b-3p启动子表达，见表2；RIP法检测circ-RPPH1与miR-146b-3p关系表明，circ-RPPH1可与miR-146b-3p相结合，见表3。紫杉醇耐药组患者血清miR-146b-3p表达水平为0.84±0.41，低于敏感组(3.12±0.75)，差异有统计学意义(t=14.109，P<0.001，图14)；乳腺癌耐药患者血清中circ-RPPH1与miR-146b-3p表达水平呈负相关(r=-0.754，P<0.001，图15)。

图13 circ-RPPH1与miR-146b-3p具有靶向关系

表2 野生型及突变型circ-RPPH1与miR-146b-3p结合后荧光数

表3 circ-RPPH1与miR-146b-3p结合后IgG、Ago2检测

图14 两组患者血清miR-146b-3p表达水平比较

图15 circ-RPPH1与miR-146b-3p表达水平呈负相关

2.12 miR-146b-3p与MUC19之间存在靶向关系

用TargetScan对miR-146b-3p的靶基因进行预测，推测miR-146b-3p与MUC19之间存在一定的靶向关系，见图16。双荧光素酶报告系统检测，见野生型MUC19 3′UTR与miR-146b-3p结合后可检测荧光数量较前减少，提示miR-146b-3p可与野生型MUC19结合且负向调控，见表4。RIP检测二者关系结果显示，miR-146b-3p可与MUC19结合，见表5。紫杉醇耐药组患者血清MUC19吸光度值高于敏感组(4.73±1.01vs.1.51±0.55)，差异有统计学意义(t=13.961，P<0.001，图17)；乳腺癌耐药患者血清MUC19与miR-146b-3p表达水平呈负相关(r=-0.562，P<0.001，图18)。

图16 miR-146b-3p与MUC19之间存在靶向关系

表4 miR-146b-3p与野生型及突变型MUC19结合后荧光数

表5 miR-146b-3p与MUC19结合后IgG、Ago2检测

图17 两组患者血清MUC19吸光度值比较

图18 MUC19与miR-146b-3p表达水平呈负相关

2.13 敲低circ-RPPH1肿瘤的生长情况

敲低circ-RPPH1后23 d，sh-circ-RPPH1组肿瘤体积较sh-NC组缩小[(410±90)mm3vs.(890±130)mm3]，差异有统计学意义(t=-5.263，P=0.006，图19、20)；sh-circ-RPPH1组瘤体质量较sh-NC组降低[(400±120)mgvs.(840±160)mg]，差异有统计学意义(t=-3.812，P=0.019，图21)；sh-circ-RPPH1组肿瘤中circ-RPPH1表达水平较sh-NC组下降(0.39±0.07vs.1.00±0.09)，差异有统计学意义(t=-9.267，P<0.001)。

图19 裸鼠肿瘤照片

图20 肿瘤体积变化

图21 肿瘤质量变化

3 讨论

乳腺癌耐药仍是制约乳腺癌治疗的一大瓶颈，其分子作用机制尚不完全明确，探究乳腺癌耐药的发生机制，寻找新的标志物来有效逆转乳腺癌耐药，对于降低乳腺癌术后复发、转移及提高生存率具有重要意义。现已证实外泌体是细胞通讯中重要的调节者，其主要参与细胞间的物质交换和信息交流，在多种生理和病理过程中发挥重要作用[12]。已有多项研究发现外泌体参与调控乳腺癌耐药过程，如Tang等[13]研究发现，血清外泌体HOTAIR具有作为诊断和预后生物标志物的潜力，HOTAIR高表达与乳腺癌患者生存率和化疗敏感性显著相关。Zheng等[14]研究发现，外泌体lnc-AGAP2-AS1在曲妥珠单抗乳腺癌耐药细胞中表达升高，抑制lnc-AGAP2-AS1的表达可以增加化疗敏感性，含lnc-AGAP2-AS1的外泌体与敏感细胞共培养可减少曲妥珠单抗诱导的细胞死亡。Wang等[15]研究发现，乳腺癌耐药细胞中lnc-H19的表达增加，抑制H19可有效降低细胞活力、诱导细胞凋亡并显著降低乳腺癌对阿霉素的耐药性。此外，细胞外的H19可以通过与外泌体结合转移到敏感细胞。用耐药细胞的外泌体处理敏感细胞可增加敏感细胞的耐药性，而下调敏感细胞中的H19则可增加细胞对阿霉素的敏感性。Dong等[16]发现外泌体lnc-SNHG14能够参与调节曲妥珠单抗的耐药性，外泌体lnc-SNHG14可能通过靶向Bcl 2/BAX信号通路来影响曲妥珠单抗的化疗敏感性。本研究结果显示，circ-RPPH1在乳腺癌患者血清、乳腺癌细胞系中表达升高，特别在紫杉醇耐药细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中表达明显增高；circ-RPPH1由外泌体包裹转运，circ-RPPH1表达量可影响乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性，提示circRNA与肿瘤耐药密切相关，有望成为一种新型生物标志物及临床治疗靶点。

目前大量研究发现circRNA参与调控乳腺癌的发生发展过程[17]。Yang等[18]研究发现，敲低circ-ABCB10可促进乳腺癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性，抑制紫杉醇耐药细胞的侵袭和自噬，其作用机制是circ-ABCB10通过海绵化let-7a-5p影响DUSP7的表达，进而调节紫杉醇耐药细胞的敏感性、凋亡、侵袭及自噬等过程。Liang等[19]研究发现，circ-KDM4C在乳腺癌组织中表达降低，且较低的circ-KDM4C表达与乳腺癌的不良预后和转移有关，且circ-KDM4C在体内外都能显著抑制乳腺癌的增殖、转移及阿霉素耐药性，其作用机制是circ-KDM4C通过靶向miR-548p/PBLD轴影响乳腺癌细胞的生物学过程。Liang等[20]研究发现，circ-BMPR2在乳腺癌转移组织中表达较低，circ-BMPR2的表达与乳腺癌细胞的活力呈负相关；功能研究发现敲低circ-BMPR2可有效促进细胞的增殖、迁移和侵袭，下调circ-BMPR2可增加乳腺癌细胞对他莫西芬的耐药性；机制研究发现circ-BMPR2可能作为miR-553的海绵发挥作用，进而减轻对USP4的抑制，从而抑制乳腺癌的进展及其对他莫西芬的耐药。Sang等[21]建立耐他莫西芬的MCF-7细胞株，并通过RNA测序对其环状RNA表达谱进行筛选，发现hsa_circ_0025202在耐药细胞株和肿瘤组织中表达较低，功能研究证实hsa_circ_0025202可以抑制细胞增殖、集落形成和迁移，增加细胞凋亡和对他莫西芬的敏感性。机制研究证实hsa_circ_0025202可海绵化miR-182-5p调控FOXO3a的表达从而发挥抑瘤作用以及增加对他莫西芬的敏感性。上述研究为circRNA在乳腺癌中的研究奠定重要基础。本研究显示干扰circ-RPPH1的表达后乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231及乳腺癌耐紫杉醇细胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX的增殖、迁移、侵袭能力下降，细胞合成受阻，提示circ-RPPH1与乳腺癌发展存在密切关系，本研究也通过体外裸鼠实验证实了这一点。同时本研究通过使用TargetScan、interactome预测circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19之间存在一定的靶向关系，并通过实验证实了该推测。

综上所述，circ-RPPH1通过外泌体包裹转运调控circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19通路轴对乳腺癌耐药细胞株生物学功能的影响，在调控乳腺癌耐药细胞耐药、增殖、克隆、迁移和侵袭能力等方面发挥重要作用；敲低circ-RPPH1表达可抑制乳腺肿瘤生长。