维生素D通过调控磷脂酰肌醇3激酶信号通路对妊娠糖尿病小鼠糖脂代谢的影响及机制研究Δ

崔丽娟，薛 洁，彭志美

(邯郸市第一医院产科，河北 邯郸 056000)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期间由胰岛素分泌紊乱或胰岛素功能障碍引起的，为妊娠期常见并发症[1]。据报道，我国2013年GDM的发病率在5%～10%[2]。随着社会经济的发展及生活水平的提高，GDM发病率逐年升高，增加了妊娠及生产风险，给母婴健康造成严重危害，及时干预治疗对于母体及胎儿具有重要意义。维生素D属于类固醇激素，一般由皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射合成，病理性缺乏时则通过药物补给[3]。维生素D可以保护胰岛β细胞，促进肝糖原合成；维生素D缺乏会导致糖代谢异常，引起血糖水平升高，增加糖尿病发生风险[4-5]。但维生素D在体内的作用机制尚不明确。研究结果表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号通路为胰岛素转录的重要途径，其信号分子的异常可能参与GDM的发生和发展[6]。本研究通过于妊娠期小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建小鼠GDM模型，观察维生素D对GDM小鼠糖脂代谢的作用，并通过PI3K信号通路阐述维生素D调节糖脂代谢的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雌性昆明小鼠80只，雄性昆明小鼠40只，体质量18～20 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号为SCXK(浙)2019-0004。所有小鼠适应性喂养1周，湿度为(50±5)%，温度为(22±3)℃，自由饮食进水。测定小鼠空腹12 h血糖，均≤6.1 mmol/L。

1.1.2 仪器：CM1520型冷冻切片机、DM500型显微镜(日本Leica公司)；TRUE MTRIX型血糖仪(湖南三诺生物传感股份有限公司)；D10型糖化血红蛋白检测仪(美国Bio-Rad公司)；iMark型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Nanodrop2000型超微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)；ABI7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；CheniDoc XRS+型化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司)；HE-120型水平电泳、VE-180型垂直电泳(上海天能科技有限公司)。

1.1.3 药品与试剂：维生素D滴剂[国药控股星鲨制药(厦门)有限公司，批准文号为国药准字H35021450，批号为12923002，规格为400 IU/粒(国际标准：1 IU维生素D=0.025 μg维生素D3)]；柠檬酸钠、STZ(美国Sigma公司，货号为S0130)；激动剂(茴香霉素，德国Merck公司，货号为A5862，规格为10 mg/支)；三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及总胆固醇(TC)试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号为A110-1-1、A113-1-1及A111-1-1)；空腹胰岛素(FINS)试剂盒(上海研吉生物科技有限公司，货号为BS-E7687H1)；苏木精-伊红染色(HE染色)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号为G1120)；兔抗鼠PI3K、葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)、蛋白激酶B(AKT)和小鼠抗大鼠GAPDH抗体(美国Abcam公司，货号为ab283852、ab33780、ab38449和ab8245)；蛋白Marker[宝日医生物技术(北京)有限公司]；2×SYBR Green荧光染料(美国Roche公司)；反转录试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒和ECL显影液(美国Bio-Rad公司，货号为12004856、5000114和1705062)。

1.2 方法

1.2.1 妊娠期小鼠的筛选及分组：雌性与雄性小鼠2∶ 1合笼饲养，每日清晨进行雌鼠阴道检查，以阴栓和精子为受孕标记，记为妊娠第1日。将75只妊娠期昆明小鼠，随机分为五组，即对照组、GDM组、维生素D低剂量组、维生素D高剂量组和激动剂组，每组15只。

1.2.2 模型制备：确定妊娠后第1日，GDM组、维生素D低剂量组、维生素D高剂量组和激动剂组小鼠连续3 d腹腔注射50 mg/kg STZ(STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，配制STZ原液20 mg/mL，pH为4.4±0.3)，1日1次，最后1次注射后空腹12 h，测定空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L为造模成功[7]。GDM组12只、维生素D低剂量组13只、维生素D高剂量组14只和激动剂组12只小鼠造模成功。对照组小鼠每日腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。妊娠期间，对照组小鼠饲喂普通饲料维持饲养，其余组小鼠饲喂高糖高脂饲料。

1.2.3 干预方法：从妊娠第8日开始，对照组、GDM组小鼠每日灌胃花生油0.05 mL，维生素D低剂量组、维生素D高剂量组小鼠每日分别灌胃维生素D(溶于0.05 mL花生油)0.05、0.20 μg/kg，至妊娠第19日结束。激动剂组小鼠从第8日开始，每日灌胃维生素D(溶于0.05 mL花生油)0.20 μg/kg+腹腔注射茴香霉素2 mg/kg，至妊娠第19日结束。

1.2.4 组织收集：妊娠第19日给药结束后2 h处死小鼠，每只取血2.5 mL，4 ℃下静置1 h，以4 500 r/min离心(离心半径为13.5 cm)10 min，置于-20 ℃保存备用。取部分肝组织以0.9%氯化钠溶液清洗后，用甲醛固定，用于HE染色；部分置于-80 ℃保存，用于基因及蛋白提取，后续通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及蛋白质印迹法检测。

1.2.5 血糖化血红蛋白(HbA1c)、FBG、FINS、TC、TG和LDL-C水平测定：采用血糖仪测定FBG水平，采用糖化血红蛋白仪测定HbA1c水平。取-20 ℃冻存血清，通过酶联免疫吸附试验测定FINS、TC、TG和LDL-C水平，按照试剂盒说明操作，测定光密度(OD)，根据标准曲线，计算各指标含量。

1.2.6 肝脏病理学检查：采用多聚甲醛固定肝组织后通过乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚度为5 μm，60 ℃烘干，HE染色，待二甲苯彻底脱水透明后以中性树胶封盖，于显微镜下观察肝细胞损伤情况。

1.2.7 PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相对表达量检测：用液氮冻存小鼠肝脏组织，匀浆提取RNA并测定含量，逆转录合成cDNA，-20 ℃稳定保存，反应体系为RNAase free水 8 μL，dT18 1.5 μL，RNA 5.5 μL。RT-qPCR反应体系为上下游引物(浓度10 μmol/L)各1 μL，cDNA 3 μL，预混液(Ex Taq)12 μL，ddH2O 8 μL。反应程序为98 ℃，10 min；95 ℃，45 s；59 ℃，30 s；72 ℃，60 s；共45个循环。以GAPDH为内参，记录反应CT值，计算PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相对表达量(2-△△CT法)，上下游引物序列见表1。

1.2.8 PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4蛋白相对表达量检测：取肝组织80 mg，以液氮研磨后加入RIPA裂解液1 mL，4 ℃、12 000 r/min下离心(离心半径为13.5 cm)15 min，通过BCA法测定蛋白含量。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，上层浓缩胶，下层分离胶，蛋白样品与上样缓冲液混合后，使用移液枪加入上样孔，120 V浓缩胶电泳，200 V分离胶电泳至结束。取甲醇活化后的PVDF膜湿转印100 V、60 min，封闭PVDF膜2.5 h后加入已稀释一抗(1∶ 5 000)，4 ℃过夜，次日加入稀释二抗(1∶ 2 500)，常温孵育2 h，TBST冲洗后加入ECL孵育5 min，曝光成像，对比PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4与GAPDH灰度值计算蛋白表达情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 五组小鼠糖代谢指标FBG、HbA1c和FINS水平比较

与对照组比较，GDM组小鼠FBG、HbA1c和FINS水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与GDM组比较，维生素D低剂量组、维生素D高剂量组及激动剂组小鼠FBG、HbA1c和FINS水平均降低，其中维生素D高剂量组低于维生素D低剂量组和激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)；维生素D低剂量组与激动剂组小鼠FBG、HbA1c和FINS水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2五组小鼠糖代谢指标FBG、HbA1c和FINS水平比较Tab 2 Comparison of FBG, HbA1c and FINS among

2.2 五组小鼠脂代谢指标TC、TG和LDL-C水平比较

与对照组比较，GDM组小鼠TC、TG和LDL-C水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与GDM组比较，维生素D低剂量组、维生素D高剂量组及激动剂组小鼠TC、TG和LDL-C水平均降低，其中维生素D高剂量组低于维生素D低剂量组和激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)；维生素D低剂量组与激动剂组小鼠TC、TG和LDL-C水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 五组小鼠脂代谢指标TC、TG和LDL-C水平比较Tab 3 Comparison of TC, TG and LDL-C among five

2.3 五组小鼠肝组织病理学染色观察

对照组小鼠肝细胞及肝小叶结构正常；GDM组小鼠肝细胞凌乱松散，嗜酸性脂肪病变，肝索结构紊乱；维生素D低剂量组小鼠肝细胞排列稍乱，肝小叶结构少量炎细胞浸润，未见病灶坏死；维生素D高剂量组肝细胞排列整齐，汇管区未见炎症，少量肝细胞脂肪变性；激动剂组肝小叶结构正常，散在脂肪细胞变性，未见组织增生，见图1。

图1 肝组织病理学切片(HE，×100)Fig 1 Liver histopathology (HE，×100)

2.4 五组小鼠肝组织中PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相对表达量比较

五组小鼠肝组织中AKT mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，GDM组小鼠肝组织中PI3K、GLUT-4 mRNA相对表达量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与GDM组比较，维生素D低剂量组、维生素D高剂量组及激动剂组小鼠肝组织中PI3K、GLUT-4 mRNA相对表达量升高，其中维生素D高剂量组高于维生素D低剂量组和激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)；维生素D低剂量组与激动剂组小鼠肝组织中PI3K、GLUT-4 mRNA相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 五组小鼠肝组织中PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相对表达量比较Tab 4 Comparison of relative expression of PI3K, AKT, GLUT-4 mRNA in liver tissues among five groups

2.5 五组小鼠肝组织中PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4蛋白相对表达量比较

五组小鼠肝组织中AKT蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，GDM组小鼠肝组织中PI3K、p-AKT和GLUT-4蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与GDM组比较，维生素D低剂量组、维生素D高剂量组及激动剂组小鼠肝组织中PI3K、p-AKT和GLUT-4蛋白相对表达量升高，其中维生素D高剂量组高于维生素D低剂量组和激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)；维生素D低剂量组与激动剂组小鼠肝组织中PI3K、p-AKT和GLUT-4蛋白相对表达量的差异均无统计学意义(P>0.05)，见图2、表5。

图2 蛋白条带Fig 2 Western blot protein bands

表5 五组小鼠肝组织中PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4蛋白相对表达量比较Tab 5Comparison of relative expression of PI3K, AKT, p-AKT,GLUT-4 protein in liver tissues among five groups

3 讨论

GDM的发生可导致机体在妊娠期间出现糖代谢异常，引起先兆子痫、胎儿过大、分娩损伤甚至炎症感染等一系列生产风险，严重影响妊娠期妇女及胎儿的生命安全[8-10]。PI3K通路与胰岛素细胞活化、胰岛素合成和血糖调节等过程息息相关[11]。维生素D的主要作用是维持钙磷稳态和促进骨骼发育，近年来有研究结果表明，维生素D可以上调胰岛素转录基因表达，增加胰岛素分泌，促进葡萄糖转运，抑制脂肪合成，防止脂质积累，维持机体糖脂代谢平衡，因此，维生素D缺乏可能是导致糖脂代谢紊乱的原因之一[12-14]。但维生素D在GDM中的具体作用机制仍不明确。本研究通过探讨PI3K通路阐述维生素D调控糖脂代谢的作用机制，为进一步阐明维生素D参与GDM发生发展奠定基础。

本研究结果发现，GDM组小鼠肝细胞排列杂乱，嗜酸性脂肪病变，肝索结构紊乱，肝小叶可见少量结缔组织增生，提示GDM小鼠存在肝损伤。肝脏是胰岛素作用的重要器官，可以合成肝糖原，降低血糖水平[15]。有研究结果显示，STZ对胰岛β细胞有高度特异毒性，可以导致胰岛素分泌减少，无法维持血糖稳定，故STZ成为构建糖尿病模型的理想药物[16]。本研究的病理结果显示，维生素D各剂量组及激动剂组小鼠肝细胞损伤均减轻，其中维生素D高剂量组病变较轻，提示维生素D可以减轻GDM小鼠的肝损伤。与对照组比较，GDM组小鼠FBG、HbA1c、FINS、TC、TG和LDL-C水平均升高，提示GDM小鼠存在糖脂代谢紊乱；与GDM组比较，维生素D低剂量组、维生素D高剂量组上述糖脂代谢指标水平均降低，且维生素D高剂量组更低，提示维生素D可以调节GDM小鼠的糖脂代谢水平。HbA1c是血糖及血红蛋白的代谢物，其含量是衡量血糖控制的“金标准”[17-18]。HbA1c结合FBG及FINS水平可反映糖尿病患者体内糖代谢水平。HbA1c水平紊乱可导致游离脂肪酸水平升高，多种酶活性降低，TC、TG和LDL-C水平升高，造成脂代谢紊乱。

PI3K属于磷酸化磷脂酰肌酶家族，胰岛素通过结合胰岛素β受体可激活PI3K，PI3K活化后将信号传递至GLUT-4，进而调节下游信号分子，调整机体糖脂代谢[19-21]。本研究结果发现，与对照组比较，GDM组小鼠肝组织中PI3K、GLUT-4 mRNA和蛋白相对表达量及p-AKT蛋白相对表达量均降低；与GDM组比较，维生素D低剂量组、维生素D高剂量组小鼠肝组织中PI3K、GLUT-4 mRNA和蛋白相对表达量及p-AKT蛋白相对表达量均升高，且维生素D高剂量组最高，提示维生素D可以激活GDM小鼠肝脏中PI3K通路，激活PI3K、GLUT-4活性及AKT蛋白磷酸化水平。本研究在维生素D基础上进一步应用PI3K激动剂干预，结果显示，激动剂组小鼠肝组织中PI3K、GLUT-4 mRNA和蛋白相对表达量及p-AKT蛋白相对表达量低于维生素D高剂量组，且糖脂代谢指标高于维生素D高剂量组，证实维生素D的确可通过PI3K信号通路改善GDM糖脂代谢紊乱，促进机体糖脂代谢平衡，并且随着剂量增加，可以进一步上调PI3K通路表达。

综上所述，维生素D可能通过调控PI3K通路，改善肝细胞损伤。本研究可为维生素D在GDM中的科学应用提供依据。