玉米MYB转录因子蛋白应答干旱胁迫功能研究

周晓馥，刘美琦，金妍，徐洪伟*

(1.吉林师范大学 生命科学学院，吉林 四平 136000；2.吉林师范大学 吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室，吉林 四平 136000)

0 引言

玉米(ZeamaysL.)占据世界粮食总产量的第一位，同时玉米也是重要的工业原料及饲料.但实际生产中玉米会因受到诸多不利因素导致产量大大降低，如干旱、低温、盐胁迫等[1].MYB转录因子是植物中最大的一类转录因子家族，MYB蛋白在抵抗非生物胁迫调控中有重要作用.对玉米MYB转录因子家族进行功能分类和分析鉴定，可为玉米MYB转录因子家族蛋白的抗旱功能研究奠定基础，为研究玉米MYB转录因子家族蛋白应答干旱胁迫提供重要借鉴.MYB转录因子，在植物中家族成员数量较多，在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(ZeamaysL.)和水稻(OryzasativaL.)中MYB类转录因子各有168、203和130个[2].MYB转录因子家族成员都具有高度保守的MYB结构域.通常根据其所包含的MYB结构域的重复数量将MYB类转录因子分为MYB-related、R2R3-MYB(2R-MYB)、3R-MYB和4R-MYB四类，R2R3-MYB类蛋白在其N端含有DNA结合结构域，C端含有激活或抑制结构域，其参与植物生长发育、代谢、胁迫以及代谢等生理机制的调节[3-4].目前MYB转录因子家族已被证明参加了植物对干旱的应答[5]，研究发现，苦荞麦中的FtMYB9过表达可以提高转基因拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性[6]，苦荞麦FtMYB13可以提高拟南芥的耐盐和耐旱性[7]，大麦转录因子HvMYB1是耐旱性的正调控因子[8]，玉米MYB转录因子ZmMYB3R的表达可以提高转基因植株的干旱和盐胁迫耐受性[9]，杨树中的PtrMYB94与ABA信号协同作用，可以提高植物的抗旱性[10].由于玉米作为人类赖以生存的重要粮食作物之一，其产量和品质受种植区域干旱胁迫的影响较为严重.通过挖掘应答干旱胁迫的玉米MYB转录因子，分析其蛋白结构，可为揭示玉米抗旱功能分析奠定基础.本研究通过对玉米和拟南芥中具有抗胁迫功能的MYB家族成员构建系统发育进化树，进而预测玉米中与抗旱功能有关的MYB转录因子，为阐明玉米转录因子MYB家族应对干旱胁迫的功能奠定一定基础.

1 材料和方法

1.1 玉米MYB转录因子的获取和鉴定

从植物转录因子数据库PlantTFDB(planttfdb.gao-lab.org)上搜索玉米MYB转录因子，并下载所有的氨基酸序列.随后使用Pfam(http：//pfam.xfam.org/)数据库进行MYB结构域的识别，将得到的玉米MYB转录因子分类并汇总记录.拟南芥的R2R3-MYB和MYB-related成员主要从TAIR数据库中下载获得.

1.2 玉米MYB蛋白理化性质分析

从植物转录因子数据库中获得玉米MYB蛋白的理化性质，包括氨基酸(aa)、相对分子质量(MW)、等电点(PI)、功能等信息.

1.3 玉米MYB转录因子的保守基序预测

为了研究蛋白序列中除MYB重复以外的保守基序，利用MEME在线软件(http：//memsuite.org/index.html)分析玉米MYB蛋白全长序列，随后用TBtools软件进行保守基序可视化分析.

1.4 玉米MYB转录因子蛋白结构域分析

为了研究玉米MYB转录因子抗旱蛋白的结构域，基于玉米具有抗旱功能的MYB转录因子蛋白全长序列，通过TBtools软件进行蛋白结构域可视化分析.

1.5 玉米MYB转录因子蛋白亚细胞定位

对玉米MYB转录因子抗旱蛋白进行亚细胞定位，使用ProtComp进行分析，获得相应的蛋白质定位结果.

1.6 玉米MYB转录因子蛋白质二级和三级结构预测

利用SOPMA在线软件预测玉米MYB转录因子抗旱蛋白质的二级结构，利用SWISS-MODLE对其进行三级结构预测.

1.7 玉米MYB转录因子的功能预测

为了预测玉米MYB转录因子蛋白的功能，采用MUSCLE对玉米MYB序列与拟南芥MYB序列进行多序列比对，借助于MEGA11.0软件将玉米MYB转录因子蛋白与拟南芥MYB转录因子蛋白进行系统进化树的构建.

2 结果与讨论

2.1 玉米MYB转录因子鉴定

利用PlantTFDB数据库，通过关键词“MYB”和“Zeamays”获得203个玉米MYB转录因子，如表1所示.依据MYB结构域重复数目的不同，将其分为五类：MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB及5R-MYB.其中，数量最多的是R2R3-MYB类，有176个，占总数的86.7%.根据玉米MYB转录因子家族的命名方法，命名为Zm2RMYB1-Zm2RMYB176.其次为MYB-related类，有20个，命名为Zm1RMYB1-Zm1RMYB20.3R-MYB类有6个，命名为Zm4RMYB1-Zm4RMYB6.5R-MYB类只有1个，命名为Zm5RMYB1.为了解玉米MYB蛋白的特点，分析了玉米MYB的蛋白理化性质，结果如表1所示：玉米MYB蛋白编码188～1 060个氨基酸；玉米MYB蛋白家族的相对分子质量在20 693.7～117 692 kD之间；玉米MYB蛋白家族的等电点在4.297 7～12.297 4之间.

表1 玉米MYB转录因子的分类及性质

2.2 玉米MYB转录因子的保守基序分析

为了解玉米MYB转录因子的进化关系，构建了玉米203个MYB转录因子的进化树，如图1所示.玉米MYB转录因子R2R3-MYB类聚在一起，其中有少数的MYB-related类与R2R3-related类聚集在一起.为进一步了解玉米MYB蛋白结构，通过在线软件MEME对玉米MYB蛋白的保守基序进行预测，利用TBtools 软件获得结果图2.由图可知，玉米的四类MYB转录因子中存在的Motif有差异，通常同一类MYB转录因子中Motif的分布情况较相似.R2R3-MYB 类蛋白均共享Motif 1、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif6和Motif 8.3R-MYB类蛋白均共享Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 10.5R-MYB类蛋白中含有3个Motif 1.MYB-related类蛋白均含有Motif 2和Motif 3.在R2R3-MYB类蛋白中，Motif在每个基因上的相对位置是一致的，说明Motif并非随机出现，而是具有一定的保守性.

图1 玉米MYB转录因子进化树

图2 玉米MYB转录因子的保守基序

2.3 玉米MYB转录因子的功能预测

为对玉米MYB转录因子进行功能预测，将176个R2R3-MYB类转录因子和20个MYB-related类转录因子分别与拟南芥MYB转录因子进行多序列对比，利用MAGE11.0构建进化树得到结果图3和图4.根据拟南芥R2R3-MYB类转录因子划分的功能群，对玉米R2R3-MYB类转录因子的功能进行预测，玉米R2R3-MYB类转录因子可能与植物细胞的发育、植物雄性生殖器和茎的发育、植物苯丙烷类次生代谢途径的调节、植物非胁迫调节有关.以拟南芥MYB-related类转录因子的分类为依据，部分拟南芥中的转录因子在玉米中没有发现.由此可知，R2R3-MYB类蛋白在植物生长发育过程发挥作用，且不同物种中MYB-related类的蛋白在进化过程中具有一定的差异性.

图3 玉米与拟南芥R2R3-MYB类蛋白的进化树

图4 玉米与拟南芥MYB-related类蛋白的进化树

2.4 玉米MYB转录因子家族抗旱蛋白成员的鉴定

在玉米中共鉴定出203个MYB成员，其中102个MYB成员有明确的结构功能，101个MYB成员功能未知.根据功能筛选，玉米MYB成员中具有抗旱功能的蛋白有16个(如表2).16个MYB具有抗旱功能的蛋白质长度介于225～563 aa；相对分子质量大小25 246.7～61 659.3 kD；PI介于4.625 4～10.776 1.

表2 玉米MYB抗旱蛋白的性质

2.5 玉米MYB转录因子家族抗旱蛋白的亚细胞定位分析

运用ProtComp对玉米MYB抗旱蛋白进行亚细胞定位，结果显示玉米MYB抗旱蛋白均集中定位于细胞核上.

2.6 玉米MYB转录因子家族抗旱蛋白保守基序分析

本研究在玉米MYB抗旱成员中共鉴定到10个保守基序，大部分玉米MYB抗旱成员都含有 Motif 1 和 Motif 9 (如图5).R2R3-MYB类具有抗旱功能的蛋白所含保守基序种类最少.此外，本研究还发现一些特有的基序，如Motif 2、Motif 3、Motif 5、Motif 6、Motif 7、Motif 8和Motif 10为Zm3RMYB1-Zm3RMYB6所特有，且Motif的排列位置大概是相同的，并非随机出现，而是具有一定的保守性.

2.7 玉米MYB转录因子家族抗旱蛋白结构域分析

利用TBtools软件分析了16个玉米MYB抗旱蛋白结构域，由图6可知，所有的玉米MYB蛋白均含有SANT结构域，其中最复杂的结构域出现在Zm2RMYB8 成员(含有2个SANT结构域和5个LCR区域)，属于MYB转录因子家族中典型的R2R3-MYB型.最简单的结构域出现在 Zm2RMYB171成员(仅含有 SANT结构域).其中，Zm3RMYB1-Zm3RMYB6的结构域排布较为整齐，均含有3个SANT结构域，属于MYB转录因子家族中典型的R3-MYB型.

图5 玉米MYB抗旱蛋白的保守基序

图6 玉米MYB抗旱蛋白结构域

2.8 玉米MYB转录因子家族抗旱蛋白二级和三级结构预测分析

利用SOPMA在线软件预测玉米转录因子抗旱蛋白的二级结构，结果如表3所示，玉米MYB抗旱蛋白结构以无规则卷曲(Cc，random coil)和α螺旋(Hh，alpha helix)为主，并且同时包含部分的β折叠(Tt，beta turn)和延伸链(Ee，extended strand).三级结构的预测结果显示(如图7)，玉米MYB转录因子抗旱蛋白结构与二级结构预测结构较为接近，符合预测结果.其无规则卷曲占比较大，此类结构对蛋白功能的发挥有极其重要的作用.

表3 玉米MYB转录因子抗旱蛋白二级结构特征预测

图7 玉米MYB转录因子抗旱蛋白三级结构预测

续图7

2.9 玉米MYB转录因子的功能预测及进化树分析

利用101个玉米MYB转录因子家族未知功能蛋白的全长序列与已报道过具有明确功能的拟南芥MYB蛋白(如表4)共同构建了系统进化树(如图8)，更好地定位到与抗旱有关的玉米MYB蛋白[11].进化树显示，48个玉米MYB蛋白与拟南芥MYB具有抗旱功能的蛋白亲缘关系较近，表明这48个MYB蛋白可能与玉米抵抗干旱胁迫功能有关.

表4 拟南芥参与非生物胁迫的MYB转录因子

图8 玉米MYB未知功能蛋白与拟南芥MYB类蛋白的进化树

植物时常处于限制其生长发育的环境条件下，干旱胁迫是严重影响植物生长的环境因素之一[12].由于玉米作为人类赖以生存的重要粮食作物之一，其产量和品质受种植区域干旱胁迫的影响较为严重[13].MYB是真核生物中广泛存在的一类转录因子，其家族广泛参与机体生长发育、生物胁迫应答及非生物胁迫应答等过程[14-17]，因此研究玉米MYB转录因子家族蛋白应答干旱胁迫具有十分重要的意义.

拟南芥中MYB转录因子的功能研究较为透彻，AtMYB12、AtMYB75通过调节拟南芥中黄酮类物质的含量来适应干旱、高盐的环境，AtMYB60通过调控气孔关闭和根的生长来适应干旱环境，AtMYB96通过整合ABA和生长素信号来增强抵抗干旱胁迫的能力，AtMYB15在低温胁迫下，其表达量升高，AtMYB14通过调节CBFs的表达来参与抵抗低温环境，AtMYB2、AtMYB73通过参与一系列调节途径应对高盐胁迫环境，AtMYB4、AtMYB7、AtMYB32通过抑制苯丙烷各代谢分支途径基因的表达来抵抗紫外线胁迫[11].有学者认为可依据进化树中与拟南芥的亲缘关系预测研究物种蛋白的功能[18].本研究运用生物信息学的方法，对从玉米中获得203个MYB转录因子蛋白序列进行了理化性质、保守基序、蛋白结构域、亚细胞定位、结构预测、功能预测、系统进化等多方面分析，对其理化性质和蛋白结构等有了较全面的认识[19-24].

3 结论

通过对玉米MYB转录因子提交至Pfam在线软件进行分析，依据MYB结构域重复数量，将玉米MYB进行分类，共分为MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB及5R-MYB五类.根据对玉米MYB转录因子保守基序的分析，同一类家族成员具有相似的Motif且位置相同.根据PlantTFDB数据库所得的101个无明确功能的玉米MYB类转录因子编码蛋白与11个功能明确的拟南芥MYB类转录因子编码蛋白作系统进化树，证明了相邻或较近进化关系上的48个玉米MYB蛋白可能具有相同或相似的功能.

综上所述，本研究基于玉米MYB转录因子蛋白数据，通过分析玉米MYB转录因子的保守基序、蛋白结构域、亚细胞定位、结构预测和进化关系，较为系统地鉴定了玉米MYB转录因子家族.其中明确具有抗旱功能的蛋白有16个，未知功能的蛋白中有48个玉米MYB转录因子与拟南芥中主要参与抗旱的MYB转录因子存在较近的亲缘关系，推测可能与玉米抵抗干旱胁迫相关.本研究为玉米抵抗干旱胁迫的功能提供了一定的理论基础，具有重要意义.