miR-146a对急性痛风性关节炎大鼠炎症反应的影响及其可能机制▲

樊丰夷 蓝天座 杨 旸 邓 超 张 春 罗安电

(贵州省贵阳市第一人民医院肾内科，贵阳市 550004)

急性痛风性关节炎(gouty arthritis，GA)是因尿酸沉积在关节囊韧带、滑膜、软骨等关节组织中而引起的一种急性风湿性病变。流行病学研究表明，进食饮料、啤酒及大量红肉、贝类、脂肪是急性GA发作的主要原因[1]。近年来，急性GA在世界范围内的发病率呈上升趋势[2]。在急性GA的发生和发展过程中，核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 3，NALP3)起着重要作用，NALP3炎性小体主要表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞等初级免疫细胞，这些细胞主要位于皮肤、关节、眼睛、耳朵和胃肠上皮组织的内表面[3]。尿酸钠晶体(monosodium urate，MSU)可诱导NALP3炎性小体的构象变化，一旦NALP3炎性小体被激活，可导致Caspase-1促进白细胞介素前体1β(precursor interleukin 1β，pro-IL-1β)的切割和成熟，释放激活的白细胞介素(interleukin，IL)-1β，引发下游中性粒细胞活化，导致炎症加剧[4]。深入研究NALP3炎性小体的信号传导途径，或可为有效地治疗急性GA提供新的靶点。研究表明，miR-146a可以调控大鼠的1 195个靶基因，包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-6[5]。然而miR-146a是否可以通过调节NALP3炎性小体信号传导途径来影响急性GA的发生和发展尚不清楚。因此，本研究探讨miR-146a对急性GA大鼠模型炎症反应的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级雄性SD大鼠40只，6～8周龄，体重(200.0±20.0)g，由成都硕达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2019-031。严格按照动物实验室的标准对所有大鼠进行喂养，大鼠自由进食和饮水。

1.1.2 主要试剂和仪器：MSU(批号：108K53098)购自美国Sigma公司；agomiR-146a(批号：miR40000830-4-5)、antagomiR-146a(批号：miR40000830-4-5)购自广州锐博公司；RNA提取试剂盒(批号：vs18061730)购自合肥博美生物科技有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒(批号：N116)购自南京建成公司；二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(货号：P0009)购自上海碧云天生物；GAPDH(批号：B661204)购自生工生物工程上海有限公司；IL-6(批号：ZC-36404)、IL-1β(批号：ZC-36391)和TNF-α(批号：ZC-37624)ELISA试剂盒购自上海茁彩生物公司；一抗pro-IL-1β抗体(批号：ab254360)、NALP3抗体(批号：ab263899)，内参β-actin抗体(批号：ab8226)，以及二抗生物素化山羊抗兔IgG(批号：ab6721)均购自英国Abcam公司。TB718型生物组织包埋机购自湖北泰维电子有限公司；MK3型酶标仪购自美国Thermo公司；Tanon-5200 Multi型凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司；BA210Digital型数码三目摄像显微镜购自麦克奥迪实业集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组和急性GA大鼠模型建立：按随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、agomiR-146a组、antagomiR-146a组，每组10只。除空白组外，其余各组均采用单侧踝关节腔注射200 μL MSU溶液(2.5 g/100 mL)的方法建立急性GA大鼠模型，以关节囊对侧鼓起为造模成功的标准[6]，造模过程无大鼠死亡。于造模当天及造模后3 d、5 d、7 d、10 d，分别于agomiR-146a组、antagomiR-146a组大鼠踝关节腔内注射10 μL agomiR-146a、10 μL antagomiR-146a，于空白组、模型组大鼠踝关节腔内注射等量生理盐水。

1.2.2 大鼠滑膜组织病理学观察：造模后10 d踝关节腔内注射药物后2 h，采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，取以受试踝关节为中心的上下1 cm部位，快速分离出踝关节滑膜组织，一部分置于-80 ℃低温保存，另一部分置于4%多聚甲醛中固定。将置于4%多聚甲醛中固定的滑膜组织经全自动脱水机脱水后，行包埋、制作切片，苏木精染色10～20 min后，自来水冲洗1～3 min，然后用盐酸酒精分化5～10 s，自来水冲洗1～3 min后，放入50 ℃的温水中或用弱碱性水溶液返蓝，直到出现蓝色为止，自来水冲洗1～3 min，放入85%的酒精3～5 min，伊红染色3～5 min，水洗3～5 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，采用BA210Digital数码三目摄像显微镜观察组织的病理变化情况。

1.2.3 ELISA检测滑膜组织中炎症细胞因子的表达水平：取于-80 ℃低温保存的滑膜组织(1 cm×1 cm)，将其剪切成4 mm×4 mm大小，并置于EP管中，加入适量的组织裂解缓冲液，然后用研磨机充分粉碎。将组织置于冰上静置15 min，然后在4 ℃下以5 000 r/min离心5 min，将上清液转移到另一个新的EP管中，按照ELISA试剂盒的说明书检测滑膜组织中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达水平。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测滑膜组织NALP3、TNF-α、IL-1β的mRNA表达量：取于-80 ℃低温保存的滑膜组织50 mg，置于EP管中，用冰块研磨机研磨组织，加入TRIzol试剂，直至总体积为1 mL，孵育5 min后，加入氯仿，猛烈摇动15 s，孵育15 min后，将水层转移到另一根新的EP管中，然后加入异丙醇，4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，弃上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，4 ℃下以5 000 r/min离心3 min，弃上清，EP管底部的沉淀即为RNA。将RNA反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测mRNA的表达量。NALP3引物序列为5′-CGTGGTTTCCTCCTTTTGTATT-3′(正向)、5′-CGACCTCCTCTCCTCTCTTCTT-3′(反向)；TNF-α引物序列为5′-ACAAAGGTGCCGCTAACCACATGT-3′(正向)、5′-ATGCTGCTGTTTCAGTCGAAGGCA-3′(反向)；IL-1β引物序列为5′-GGGCCTCAAAGGAAAGAATC-3′(正向)、5′-CTCTGCTTGTGAGGTGCTGA-3′(反向)；GAPDH引物序列为5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′(正向)、5′-CCACGACATACTCAGCACCAGCATCA-3′(反向)。PCR反应体系见表1。反应条件为94 ℃反应5 min，94 ℃反应30 s，57 ℃反应30 s，72 ℃反应30 s，共40个循环，72 ℃反应5 min。以GAPDH为对照基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 PCR反应体系

1.2.5 Western blot检测NALP3、pro-IL-1β蛋白的表达水平：取于-80 ℃低温保存的滑膜组织50 mg，加入RIPA裂解液(质量比为组织 ∶裂解液=1 ∶10)，用灭菌剪刀将组织剪碎，置于碎冰上裂解10 min，收集裂解液，4 ℃下以12 000 r/min离心10 min后，取上清液，用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。然后进行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白转移到PVDF膜上，将膜在含5%脱脂牛奶的封闭液中室温封闭2 h后，在4 ℃下与pro-IL-1β、NALP3、β-actin一抗(1 ∶1 000)孵育过夜。用Tris缓冲盐溶液和TBST洗涤3次(5 min/次)后，将膜与相应的二抗(1 ∶5 000)在室温下孵育1 h，通过增强化学发光显影，使用凝胶成像仪扫描及记录数据，以β-actin为内参计算目的蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠滑膜组织的病理学变化 空白组大鼠滑膜组织结构清晰完整，未见明显病理改变。模型组大鼠滑膜组织衬里下层有大量炎性细胞浸润，可见大量淋巴细胞聚集成团，并有大量纤维组织增生，成纤维细胞核呈椭圆形。agomiR-146a组大鼠滑膜组织结构清晰完整，衬里层由单层或双层滑膜细胞组成，排列疏松且部分不连续，衬里下层结构疏松，可见较多的脂肪细胞、少量成纤维细胞、巨噬细胞和少量血管组成的结缔组织，无炎性细胞浸润及纤维组织增生。antagomiR-146a组滑膜组织衬里下层可见大量炎性细胞浸润，并有较多纤维组织增生，成纤维细胞核呈椭圆形。见图1。

图1 4组大鼠滑膜组织病理变化(HE染色，×400)

2.2 4组大鼠滑膜组织TNF-α、IL-1、IL-6表达水平的比较 与空白组比较，模型组大鼠滑膜组织的TNF-α、IL-1、IL-6表达水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，agomiR-146a组大鼠滑膜组织的TNF-α、IL-1、IL-6表达水平均降低，而antagomiR-146a组上述指标升高(均P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠滑膜组织TNF-α、IL-1、IL-6表达水平的比较(x±s)

2.3 4组大鼠滑膜组织NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表达水平的比较 与空白组比较，模型组大鼠滑膜组织的NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表达水平均高于空白组(均P<0.05)；与模型组比较，agomiR-146a组大鼠滑膜组织的NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表达水平均降低(均P<0.05)；而antagomiR-146a组大鼠滑膜组织的NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表达水平与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组大鼠滑膜组织NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.4 4组大鼠滑膜组织NALP3、pro-IL-1β蛋白表达水平的比较 与空白组比较，模型组大鼠滑膜组织的NALP3、pro-IL-1β蛋白表达水平均高于空白组(均P<0.05)；与模型组比较，agomiR-146a组大鼠滑膜组织的NALP3、pro-IL-1β蛋白表达水平均降低(均P<0.05)；而antagomiR-146a组大鼠滑膜组织的NALP3、pro-IL-1β蛋白表达水平与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4、图2。

表4 4组大鼠滑膜组织NALP3、pro-IL-1β蛋白表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

近年来，急性GA的发病率明显升高，已成为中国最常见的炎症性关节疾病，且男性的急性GA发病率远远高于女性[6]。因此，寻找有效治疗急性GA的新靶点具有重要意义。研究表明，miR-146a在经脂多糖刺激的人单核/巨噬细胞中表达上调；在MSU作用4 h后，miR-146a在骨髓源性巨噬细胞中的表达也上调[7-8]。在类风湿性关节炎滑膜组织中miR-146a的水平显著降低，并且负向调节炎症[9]。此外，miR-146a的表达与IL-1β的基因表达平行，提示miR-146a在MSU诱导的炎症反应中起关键作用，其作用可能与IL-1β密切相关[10]。IL-1β可将中性粒细胞招募到滑膜和关节中[11]。pro-IL-1β是在Toll样受体(toll-like receptors，TLR)途径激活的基础上合成的，NALP3炎性小体可促进其成熟[12]。有学者认为，肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)和白细胞介素1受体相关激酶1(interleukin 1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)是TLR信号通路中公认的两个关键靶基因，而miR-146a作为TLR4/IRAK1/TRAF6/核因子κB信号通路的显性负调控因子，其被敲除后，对TRAK6和IRAK1功能的抑制作用减弱，从而促进促炎细胞因子的产生，加重MSU诱导的GA[13]。此外，研究表明，MSU可以触发NALP3炎性小体的激活，最终导致IL-1β的产生[14]。Zhang等[15]研究发现，在miR-146a基因敲除小鼠的巨噬细胞中，NALP3炎性小体的mRNA表达水平升高。然而，miR-146a调节急性GA发生的机制尚不清楚，此外，在体内干预miR-146a的表达是否能延缓急性GA的进展尚未明确。

本研究采用踝关节腔注射MSU的方法建立急性GA大鼠模型，并进行miR-146a表达的干预，随后检测GA大鼠滑膜组织中NALP3、炎症因子的表达水平。结果显示，miR-146a高表达明显抑制急性GA大鼠滑膜组织中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA和pro-IL-1β蛋白表达水平，以及炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达水平，这提示miR-146a可能参与急性GA炎症的负反馈调节。目前尚无研究表明miR-146a可直接靶向NALP3炎性小体成分，但有生物信息学研究表明NAPL3不包含miR-146a的结合位点[16]。本研究结果提示miR-146a高表达可抑制急性GA大鼠滑膜组织中NALP3 mRNA和蛋白的表达水平。由此推测，miR-146a可能通过间接靶向NALP3炎性小体来促进IL-1β的激活，从而参与急性GA的发生。但本研究中，抑制miR-146a的表达后NALP3的表达水平并无明显变化，或许还存在一些未知的调节机制，今后仍需深入研究以探讨其作用。

综上所述，miR-146a高表达可降低急性GA模型大鼠踝关节滑膜组织的炎症因子水平，抑制其踝关节滑膜组织NALP3的激活，其有望成为治疗急性GA的新靶点。