多囊卵巢综合征患者子宫内膜病变的基因表达谱*

李小芳，胡 克，李洁明，金文艳，陈秋平，周香城，张小伟，周嘉禾，钟明琳，李 荔

(1.广东省妇幼保健院妇科，广州 510000；2.广东省妇幼保健院妇女儿童健康研究所，广州 510000；3.广州医科大学，广州 510000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女一种常见的内分泌代谢紊乱性疾病，其发病机制复杂。PCOS患者因稀发排卵或闭经使子宫内膜长期处于增殖状态，导致子宫内膜增生病变甚至癌变。PCOS导致子宫内膜增生相关病变的具体发病机制仍不清楚，危险因素尚不明确。深入研究PCOS子宫内膜增生病变的相关危险因素是近年来的临床研究热点。早期研究者多关注于相关蛋白分子机制水平，在已发现的几个蛋白或基因中进行分析，从而验证出对疾病发生发展可能具有重要意义的蛋白质或基因，继而试图寻找重要治疗靶点及深入其功能水平的研究。但蛋白质水平研究往往是片面性、单方面及多通路的，难以从根源上反映子宫内膜病变的变化机制。子宫内膜是一种快速循环增长、分化及凋亡过程的独特组织。在PCOS患者中，异常的激素环境及代谢失衡可调控子宫内膜基因表达来改变子宫内膜的稳态，尤其可促进有缺陷的腺体和细胞增殖。随着人类基因组测序的发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据迅速增长。本研究期望从全基因水平上深入探讨PCOS患者发生子宫内膜增生病变的分子机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年3月～2019年11月于广东省妇幼保健院行宫腔镜检查+诊刮术的111例PCOS患者。根据子宫内膜病理检查结果将患者分为子宫内膜病变组(polycystic ovary syndrome with endometrial lesions，PCOS-EH)(37例，包括子宫内膜息肉及息肉样增生、子宫内膜单纯性增生、子宫内膜复杂性增生、子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌)和子宫内膜正常组(polycystic ovary syndrome with nomal endometrium，PCOS-E)(74例，包括增殖期、分泌期)。PCOS-EH组和PCOS-E组各随机选取10例，PCOS-EH组包括子宫内膜单纯性增生1例、子宫内膜复杂性增生5例、子宫内膜不典型增生3例、子宫内膜癌1例，PCOS-E均为正常增殖期子宫内膜。诊刮取出新鲜子宫内膜组织，装入1.5mL的无RNase(RNA酶)的离心管，管内有1mL RNA保存液，-20℃冰箱保存。纳入标准：(1)符合2003年鹿特丹PCOS诊断标准[1]；(2)月经初潮后3年且年龄18～40岁；(3)PCOS患者因不孕、异常子宫出血、超声发现子宫内膜回声异常或子宫内膜增厚(>14mm)行宫腔镜检查+诊刮术。排除标准：(1)绝经期PCOS，有吸烟史；(2)近6个月使用过调节血糖血脂、激素类或避孕药物；(3)合并慢性基础疾病、急慢性感染、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者；(4)宫腔镜下发现宫腔粘连、黏膜下子宫肌瘤或其他子宫肿瘤患者；(5)宫腔镜手术禁忌证患者。本研究经医院伦理委员会批准同意，患者知情同意并均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因表达谱的实验流程 基因芯片购自上海安捷伦科技有限公司，名称为G4102A，所用芯片规格SurePrint G3 Custom GE 8x60K，AMADID:071342。用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评价RNA质量，合格的RNA样品进行下一步测序。合成cDNA第一链，使用吸附柱(Spin Columns RS)纯化cRNA，并使用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计定量cRNA，杂交、组装并洗涤芯片。

1.2.2 数据扫描及提取 Cy3标记的样品用Green光扫描，Cy5标记的样品用Red光扫描，双通道标记的样品用Green+Red扫描。Agilent扫描仪所得图像为两种荧光的复合图，经Split-tiff软件分割成单色荧光图像，使用Agilent Feature Extraction Software提取数据，将图像导入图像分析软件。

1.2.3 数据分析 使用GeneSpring GX软件对基因微阵列数据进行分析，显著差异基因表达筛选标准为两个样品信号强度间的比值(ratio值)>2或<0.5(根据95%的可信区间定义)。即认为ratio值在2～0.5范围内的基因不存在显著表达差异，而ratio值>2表明该基因在PCOS子宫增生内膜中表达显著上调，ratio值<0.5表明该基因在PCOS子宫增生内膜中表达显著下调。利用SAM软件，筛选标准为差异倍数>2.5及假阳性率设置(q-value)<5%作为差异表达基因。

1.2.4 差异表达基因的GO注释和KEGG富集分析 将差异表达基因进行GO注释和KEGG信号通路富集分析，P<0.5为显著性富集，统计各个term或Pathway中的差异基因数目。通过GO注释和KEGG信号通路显著性富集分析，确定基因表达谱中的主要基因功能和参与的主要信号通路。

2 结 果

2.1 基因芯片数据的差异表达基因分析(differentially expressed genes，DEGs) 有表达的基因共29871个，通过差异基因分析发现，PCOS子宫内膜增生病变组织中存在表达差异的基因共810个，其中上调基因408个(249个显著基因)，下调基因402个(344个显著基因)，见图1。

图1 差异表达基因聚类分析图

2.2 差异基因的GO富集分析 GO生物学过程富集类别128个，分子功能富集类别23个，细胞组成富集类别19个。其中生物学过程中富集类别包括Wnt信号通路的负调控、上皮形成、细胞黏附、细胞增殖的正调控、蛋白水解作用、MAPK的激活、基因表达的正调控、成纤维细胞生长因子刺激的细胞反应等。分子功能富集类别包括整合素蛋白的结合、钙离子的结合、生长因子活性、基因金属蛋白酶活性、Wnt蛋白的结合等。

2.3 基因Pathway通路分析 利用京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库中pathway功能对差异基因进行代谢通路分析，筛选出了23条显著性代谢通路的差异基因，如有Wnt信号通路(hsa04310:Wnt signaling pathway)、细胞因子-细胞因子受体相互作用(hsa04060:Cytokine-cytokine receptor interaction)、PI3K-Akt信号通路(hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信号通路(hsa04010:MAPK signaling pathway)。

通过对差异基因GO富集分析和Pathway通路分析，在生物学功能方面，Wnt信号通路的负调控(q-value=4.96E-05)具有显著差异。利用KEGG通路分析发现，Wnt信号通路中涉及8个基因，其中2个差异基因表达下调(SFRP1=-2.70、SFRP4=-4.55)，6个差异基因表达上调(WIF1=11.88、DKK4=9.40、NKD1=8.93、WNT6=4.65、BAMBI=3.79、PRKCG=2.99)，均表达显著差异。证实Wnt信号通路分子的失调可能与PCOS子宫内膜发生增生病变关系密切。见表1、图2。

表1 Wnt信号通路基因

图2 PCOS-EH组织中Wnt失调信号传导通路注：根据NICB文献数据库查询KEGG Wnt signaling pathway所涉及的8个基因，在Wnt信号通路中推定的作用机制及途径，其中“-”表示抑制作用，“+”表示激活作用，“?”表示该基因在Wnt信号传导通路中还具有其他的传导途径

3 讨 论

3.1 PCOS子宫内膜病变中存在差异表达基因 PCOS患者子宫内膜细胞的增殖、分化、凋亡受到各种因素的影响，如无孕激素抵抗、高雄激素、高胰岛素、糖脂代谢紊乱等，这些高危因素破坏子宫内膜正常的生理病理，促进子宫内膜细胞的有丝分裂活跃，可能导致植入失败、不孕、子宫内膜增生甚至子宫内膜癌[2]。然而，PCOS-EH子宫内膜发生异常增生的病理生理学的作用机制尚未探索及明确。

目前关于PCOS正常子宫内膜的基因表达谱已有研究报道[3]，但国内外关于PCOS子宫内膜增生病变相关基因表达的研究尚缺乏。本研究利用全基因组芯片技术发现，PCOS-EH与PCOS-E患者的子宫内膜具有不同的基因表达谱，PCOS-EH子宫内膜组织中存在多种差异表达基因，其中上调基因408个(249个显著基因)，下调基因402个(344个显著基因)，如明显差异表达上调的基因有胞浆磷脂酶A2(PLA2G4D)、黏附蛋白1(MUCL1)、谷氨酸脱酸酶1(GAD1)、Wnt抑制因子1(WIF1)等，明显差异表达下调的基因有前列腺素F受体(PTGFR)、前列腺相关蛋白4(PAGE4)、黏附蛋白1类样蛋白1(MUM1L1)、类胰蛋白酶1(TPSAB1)等。

3.2 PCOS子宫内膜病变与Wnt信号通路存在相关性 研究显示，Wnt家族成员可能与多种炎性疾病有关，包括糖尿病、视网膜病变、炎症性肠炎和类风湿关节炎等。既往研究多关注于Wnt信号通路异常表达对PCOS患者慢性炎症、脂质代谢[4]的影响。如有研究发现[5]，Wnt3a低表达可能使炎症因子的分泌增加，从而导致PCOS低度慢性炎症状态的发生。研究发现[6]，PCOS患者卵巢颗粒细胞异常与Wnt信号通路有关，Wnt/β-catenin/Foxo 3a轴为治疗PCOS疾病的潜在靶点。参与炎症、脂质代谢和Wnt信号传导的基因在非肥胖PCOS脂肪组织中差异表达，微阵列分析显示多个Wnt信号基因的表达发生显着变化，包括DKK2(增加1.9倍)、JUN(减少4.1倍)和FOSB(减少60倍)。

本研究通过对差异基因GO富集分析和Pathway通路分析，发现Wnt信号通路负调控(q-value=4.96E-05)具有显著差异，2个差异基因表达下调(SFRP1=0.37、和SFRP4=0.22)，6个差异基因表达上调(WIF1=11.88、DKK4=9.40、NKD1=8.93、WNT6=4.65、BAMBI=3.79、PRKCG=2.99)，表达均显著差异。证实Wnt信号通路分子的失调与PCOS子宫内膜发生增生病变关系密切。

3.3 PCOS子宫内膜病变与Wnt信号通路作用机制 Wnt信号通路是一种高度保守传导途径，在许多生物发育过程中起着重要的调节作用。Wnt信号通路有两条[7]，一条是经典β-catenin依赖性通路，另外一条是非经典β-catenin不依赖性通路，其中非经典途径有两条细胞内传导途径：平面细胞极性通路(PCP)和Wnt/Ca2+通路。本研究发现，激活非经典通路的Wnt6基因、蛋白激酶C-γ(PRKCG)基因[8]表达明显上调(FC=4.65，FC=2.99)，证实PCOS子宫内膜增生病变发生发展与Wnt非经典传导途径的异常激活密切相关。

WIF1、NKD1都是Wnt信号通路中经典途径的抑制剂，其功能现已较明确[9]。Dickkopfs蛋白家族(DKK4)表达变化有差异[10]，相对其他抑制剂了解较少，在Wnt信号通路的分子机制作用中尚不明确。骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制剂(BAMBI)是经典Wnt/β-catenin途径的正调节剂。本研究中，BAMBI表达基因上调(FC=3.79)，经典途径的抑制因子分泌卷曲相关蛋白(SFPR1、SFPR4)表达下降，这与既往在子宫内膜癌中的表达研究相一致[11]，表明经典途径的激活和抑制减少仍对疾病的发生发展有关。但本研究发现，WIF1、NKD1抑制基因表达上调远远高于BAMBI基因的上调和SFRR1、SFPR4基因的下调(11.88、8.93 vs 0.37、0.22)，在整体上可能仍表现为Wnt经典信号传导途径的抑制。另外，SFPR4并不是单纯只抑制经典传导途径，SFPR4也能抑制Wnt信号传导通路的非经典途径。Carmon等[12]也发现，在子宫内膜癌中，Wnt7a能通过跨膜卷曲受体(Fzd10)激活平面细胞极性/JNK依赖性非经典信号传导，并且信号可被SFRP4抑制，SFRP4基因的下调，表明非经典途径的抑制减少与子宫内膜癌的肿瘤细胞侵袭作用关系密切。

综上所述，PCOS-EH与PCOS-E患者子宫内膜组织中存在明显基因表达谱差异，涉及Wnt信号通路传导异常，且主要与Wnt信号通路的非经典途径激活和经典途径的抑制相关，这组基因可作为早期预测子宫内膜增生病变的生物标记物。