HPLC双标多测法测定银黄口服液中7个成分的含量

栾永福，周广涛，许丽丽, ，马双成，孙 磊，林永强*，郭东晓*

（1. 山东省食品药品检验研究院 国家药监局胶类产品质量评价重点实验室 山东省中药标准创新与质量评价工程实验室，山东 济南 250101；2. 山东中医药大学，山东 济南 250355；3. 中国食品药品检定研究院，北京 100050）

定性和定量是药物质量评价和控制的主要技术手段，而标准物质则是成分定性和定量研究的关键因素。标准物质存在提纯困难、价格高昂、不稳定或毒性大等问题，尤其随着行业的快速发展，标准物质需求也越来越大，这些都对标准物质的供应和使用提出了更高的要求。中药成分复杂，采用多指标分析测定技术才能全面地进行药物质量评价，标准物质的短缺等因素限制了该技术的应用。为解决这一问题，目前研究使用最多的是一测多评法[1-6]，但该方法的色谱柱耐用性较差[7]，制约了该方法的应用和推广。双标多测法[8-10]是近年提出的一种新的替代对照品法，采用双标线性校正法进行定性，其原理是以两个标准物质为参照预测其他成分的保留时间，然后以双标化合物中一个标准物质为参照物，采用最大吸收波长相对校正因子法进行定量。与一测多评法相比，双标多测法在仪器、色谱柱的耐用性和定性定量准确度方面均有一定的优势，目前已经在药物分析检测领域有了较广泛、深入的研究和应用[11-14]。此外，目前已经建立了科学、系统、完善的软件分析工具──数字标准物质平台（DRS Origin），保证双标线性校正法的科学计算与应用。

银黄口服液由金银花提取物和黄芩提取物组方而成，具有清热疏风、利咽解毒之功效[15]，方中主要成分为6种咖啡酰奎宁酸和黄芩苷等。《中华人民共和国药典》2020年版一部项下，只对绿原酸和黄芩苷进行含量控制，指标单一，难以对质量进行有效控制。由于除绿原酸和黄芩苷之外的其他成分的标准物质价格较昂贵，因此本实验以DRS Origin软件为平台，采用双标多测法测定银黄口服液中6种咖啡酰奎宁酸和黄芩苷的含量，验证该方法在银黄口服液质量评价和控制中的可行性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪（配紫外检测器，美国安捷伦）；Sartorius CP225D电子天平（德国Sartorius公司）；Millipore Q-POD®超纯水处理仪（美国Millipore公司）；26根色谱柱信息见表1。

表1 色谱柱信息表

1.2 材料

绿原酸对照品（批号：110753-201415，含量：96.2 %），3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号：111782-201807，含量：94.3 %），4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号：111894-201102，含量：94.1 %），黄芩苷对照品（批号：110715-201318，含量：93.3 %，中国食品药品检定研究院）；新绿原酸对照品（批号：MUST-19031001，含量：99.67 %），隐绿原酸（批号：MUST-19032403，含量：99.07 %），3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸（批号：MUST-19031602，含量：99.05 %，成都曼斯特生物科技有限公司）。乙腈，磷酸（色谱纯，Merk公司），其余试剂为分析纯。20批银黄口服液样品来源于不同生产企业，详细信息见表2。

表2 样品信息

1.3 软件

数字化标准物质大数据平台（DRS Origin）V1.0（中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[15]

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈（A）-0.4 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，5 %A→20 %A；15～30 min，20 %A→30 %A；30～40 min，30 %A）；检测波长：327 nm；流速：1.0 ml/min，柱温：35 ℃；进样量：10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取新绿原酸对照品11.38 mg、绿原酸对照品11.38 mg、隐绿原酸对照品18.40 mg、3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸对照品11.02 mg、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品10.74 mg、4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品10.67 mg、黄芩苷对照品23.24 mg，分别置25，25，50，25，25，25，50 ml棕色量瓶中，加50 %甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液各5 ml，置同一100 ml棕色量瓶中，加50 %甲醇至刻度，摇匀，即得每1 ml各含22.68，21.90，18.23，21.83，20.26，20.08，22.17 μg的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品1 ml，置50 ml棕色量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 定性研究

2.4.1 色谱柱的筛选 在色谱柱1～25上采集对照品溶液和供试品溶液的色谱图，其中在色谱柱1、色谱柱21、色谱柱23上，绿原酸和隐绿原酸峰均未达到完全分离，故以其余22根色谱柱上7个成分的保留时间进行统计分析。

2.4.2 双标化合物的选择 将对照品溶液在上述22根色谱柱上的色谱图导入DRS Origin软件，以7个成分中任意2种成分在上述22根色谱柱上得到的保留时间平均值[标准保留时间（standard retention time，SRT）]为横坐标，以其在每根色谱柱上的实际保留时间为纵坐标，得到7个成分在每根色谱柱上的线性拟合方程，将其他5种成分的SRT代入方程，求得7个成分在每根色谱柱上的预测保留时间。根据DRS Origin软件中各色谱峰保留时间回归偏差、预测正确率和色谱柱符合率情况，按照双标选择尽量分布在保留时间区域的两端的原则，同时兼顾对照品易得程度，选择峰2（绿原酸）和峰7（黄芩苷）作为双标化合物。

2.4.3 双标线性校正法的建立 在色谱柱26上采集双标化合物（绿原酸和黄芩苷）色谱峰实际保留时间作为纵坐标，以二者的SRT为横坐标，得到双标化合物在色谱柱26上的线性拟合方程为y=0.9631x-0.0865，即建立双标线性校正法。

2.4.4 保留时间的预测与结果验证 将其他5种成分的SRT代入此方程，求得新绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸在色谱柱26上的预测保留时间。经实物对照品验证，5种成分的预测保留时间与实测保留时间的误差不超过0.5 min，结果准确，见表3。可见使用DRS Origin软件建立双标线性校正法，方法简便科学。

表3 色谱柱26上7个成分的实测保留时间和预测保留时间

2.5 定量研究

2.5.1 典型色谱图 在色谱柱26上，进行上述7个成分的定量研究，典型色谱图见图1。

图1 混合对照品和供试品的HPLC图谱

2.5.2 检测波长的确定 新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸均在327±2 nm处有最大吸收，而黄芩苷在278±2 nm处有最大吸收，故选择以327 nm作为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸的检测波长，以278 nm作为黄芩苷的检测波长。

2.5.3 相对校正因子的计算 将2.2项下的各对照品储备液分别稀释250，100，50，25，20，10倍，制成混合对照品系列稀释液，精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，依前述色谱条件进行分析，以进样量对峰面积进行回归，分别得到其余6种成分的相对校正因子（f）。

式中，As、Ar分别为待测组分和参照物的峰面积；Ws、Wr分别为待测组分和参照物的进样量。根据公式，求得新绿原酸、隐绿原酸、3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸和黄芩苷对绿原酸的f值分别为0.9606，09612，1.0243，1.2603，1.2394，1.0872。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 精密度试验 精密吸取2.2项下的混合对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，对7个对照品色谱峰的保留时间和峰面积进行统计，结果表明各对照品的保留时间和峰面积积分值的RSD均小于2.0 %，符合分析要求。

2.5.4.2 线性关系考察 分别精密吸取2.5.3项下的混合对照品系列稀释液和2.2项下黄芩苷对照品储备液各10 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。以各对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。结果表明，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸和黄芩苷进样量分别在18.15～453.70 ng、17.52～437.90 ng、16.50～412.53 ng、17.46～436.61 ng、15.19～379.84 ng、15.45～386.19 ng、17.73～4433.62 ng范围内和峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5.4.3 重复性试验 取样品1，按2.3项下方法制备供试品溶液，平行制备6份。分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液及上述供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，对7个成分色谱峰的保留时间和峰面积积分值进行统计。结果表明各对照品的保留时间和峰面积积分值的RSD均小于2.0 %，符合分析要求。

2.5.4.4 稳定性试验 取样品1，按2.3项下方法制成供试品溶液，每隔4 h进样一次，每次10 μl，测定7个成分的峰面积积分值，共考察24 h，以观察供试品溶液在检测过程中待测成分的稳定性。结果表明各对照品的保留时间和峰面积积分值的RSD均小于2.0 %，符合分析要求。

2.5.4.5 加样回收试验 取已测知含量的样品1，精密量取0.5 ml，置50 ml棕色量瓶中，分别精密加入新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸，4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸和黄芩苷对照品储备液0.75，1，1，0.5，0.2，1，20 ml，再加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行制备6份。分别精密吸取2.2项下对照品溶液及上述供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，计算含量。新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸，3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸，4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸和黄芩苷的平均回收率分别为98.62 %，102.58 %，100.41 %，104.76 %，103.17 %，102.95 %，97.39 %，RSD分别为1.93 %，1.08 %，1.10 %，0.74 %，0.92 %，0.78 %，1.13 %。表明测定方法的回收率良好。

2.5.4.6 色谱柱耐用性考察 分别考察色谱柱2～20、22、24～25，各成分分离度良好，且各成分与绿原酸的f值的色谱柱间RSD均小于2.0 %。

2.5.5 样品含量测定 精密吸取供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，平行测定2次，分别采用双标多测法和外标法测定样品中7个成分的含量，结果见表4。比较两种方法测得含量，绝对偏差（AD）均小于0.1 mg/ml，表明双标多测法可用于银黄口服液中7个成分的含量测定。

表4 样品中7个成分含量测定结果（n=2）

3 讨论

本文建立了双标多测法测定银黄口服液中6种咖啡酰奎宁酸和黄芩苷的含量，以绿原酸和黄芩苷为双标化合物，采用双标线性校正法进行色谱峰定性，同时以双标化合物中的绿原酸作为新绿原酸、隐绿原酸、3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸和黄芩苷的替代对照品，采用最大吸收波长相对校正因子法对银黄口服液进行定量研究。有研究表明，检测波长和仪器波长偏移对相对校正因子影响较大[7]，测定相对校正因子时应采用各组分最大吸收波长模式而非单一波长模式，前者能避免因仪器和环境因素改变引起的误差。将双标多测法与外标法进行对比，两种方法所测得结果绝对偏差均小于0.1 mg/ml。

中药品种众多且成分复杂，现行标准中含量测定项大多仅控制单一成分，因此替代对照品法有着广阔的应用前景。双标多测法是对替代对照品法的一种发展，提供了一种替代对照品法研究的新思路，这一方法将大大降低中药及天然药物分析检测的成本。但作为一种新的应用方法，在标准化和实用化方面，尚需进一步研究和验证。