鞣花酸对DSS诱导的溃疡性肠炎小鼠的改善及对COX2/p38/JNK/ERK/IκB-α/NF-κB和iNOS/3-NT/CYP2E1信号通路的作用

郑 志 ，姜林娟，朱 瑜，朴丙熙, ，權英珠

（1. 新乡医学院 公共卫生学院，河南 新乡 453000；2. 韩陵医药研究院有限公司，江苏 南京211100；3. 莱帕坚（株）公司，韩国 首尔 04393；4. 梨花女子大学 药学院，韩国 首尔 04393）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种急性或慢性肠道炎性疾病，其间溃疡反复发生[1]。局部长期慢性炎症的结果是肠纤维化，慢性炎症的反复刺激会使细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过多沉积，从而导致管腔直径减小、肠道狭窄甚至会发生肠梗阻，加重患者症状[2]。UC在我国的发病率迅速升高，尤其慢性UC已成为常见的消化系统疾病[3-4]。慢性UC的病程迁延反复，需长期用药和复查，不仅给患者带来巨大的身心痛苦和沉重的经济负担，也耗费了大量的医疗资源。目前慢性UC尚无规范化治疗，发病机制至今尚未完全明确。鞣花酸是一种天然酚类，主要分布于坚果、软果中，具有抗氧化、抑制增殖、诱导凋亡、阻断病毒感染、抑制炎症等生物活性功效[5]。研究报道，含鞣花酸成分的扎冲十三味丸通过多靶点调控，发挥抗炎作用，但其组成成分较多，化学成分复杂，复方物质基础及作用机制还需进一步探究[6]。本研究采用硫酸葡聚糖钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导UC动物模型，探讨鞣花酸对UC的改善效果及对环氧化酶2（COX2）、蛋白激酶p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）、核因子κB抑制蛋白α（IκB-α）、核因子κB（NF-κB）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、3-硝基酪氨酸（3-NT）、细胞色素P450 2E1（CYP2E1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1（IL-1）及一氧化氮（NO）水平的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Micro17微量离心机（美国Thermo Scientific公司）；SX-300高温高压灭菌锅（日本Tomy公司）；SDS-PAGE电泳仪（美国Bio-Rad公司）；ECL Plus蛋白质印迹检测系统（美国Cytiva公司）；HR-6型手持式组织匀浆机（上海泸析公司）；CX21光学生物显微镜（日本Olympus公司）；Pannoramic MIDI数字切片扫描仪（匈牙利3DHistech公司）。

1.2 材料

鞣花酸（美国Sigma-Aldrich，纯度＞99 %）；DSS[美国安培生物医疗器械贸易（上海）有限公司]；iNOS，3-NT，CYP2E1，COX2，磷酸化JNK（p-JNK），磷酸化ERK（p-ERK），磷酸化p38（p-p38），磷酸化IκB-α（p-IκB-α），磷酸化NF-κB（p-NF-κB）抗体及其二抗，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，美国圣克鲁斯生物技术公司）。PierceTMBCA蛋白定量检测试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）；TNF-α，IL-1β，NO酶联免疫试剂盒（美国R&D Systems公司）。

1.3 动物

30只雄性8周龄BALB/c小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司。饲养环境为温度22±2 ℃、湿度55 %±8 %，正常饮食，12 h白/暗调节（07:00～19:00）环境。

2 方法

2.1 DSS诱导炎症小鼠模型及动物分组

DSS剂量参考文献[5,7]设置，预实验后确定为60 mg/kg。小鼠进行一周适应性饲养，随机分为3组，每组10只，分别为：正常组，自由饮水+经口灌胃生理盐水；模型组，自由饮用5 % DSS溶液+经口灌胃生理盐水溶液；给药组，自由饮用5 %DSS溶液+经口灌胃鞣花酸溶液（7 g/L）。连续7 d。所有动物实验均在新乡医学院伦理委员会的伦理审查和监督下完成。

2.2 生物组织样本的采集

实验结束后，所有动物用CO2处死，心脏采血，12 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，-70 ℃保存。从底部切除肠组织5 cm，肉眼观察其损伤程度，并称重。剪出离肛门1 cm的肠组织，用PBS（pH 7.4）缓冲溶液洗3次，称重。取5 mg组织，添加含0.5 %十六烷基三甲基溴化铵的50 mmol/L PBS（pH 6.0），用手持式组织匀浆机匀浆3次，每30 s一次；-70 ℃冷冻3 h，37 ℃条件下解冻，其过程反复3次。组织匀浆液在12 000g条件下离心15 min，取上层液， -70 ℃保存。其他肠组织和肝组织用4 ℃预冷生理盐水冲洗3遍，放入10 %中性福尔马林溶液中，用于组织病理学分析。

2.3 小鼠结肠和肝组织病理学分析

采用传统苏木素-伊红染色法（hematoxylineosin staining，HE）进行。将固定好的胃和结肠组织水洗，依次经不同浓度乙醇溶液和无水乙醇脱水，用二甲苯和石蜡混合液包埋，切片，厚度为5 μm，烘干，HE染色，封片，用Pannoramic MIDI数字切片扫描仪对各组织切片进行扫描拍照，观察上皮细胞的损伤及炎症浸润等。

2.4 血液中炎症因子水平测定

采用酶联免疫试剂盒测定小鼠血清中TNF-α、IL-1β和NO水平。

2.5 Western blot检测

用PierceTMBCA蛋白定量检测试剂盒检测各结肠匀浆液中蛋白质浓度。取匀浆液（蛋白质含量50 μg）进行SDS-PAGE电泳，蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，于5 %脱脂奶粉中封闭，再分别经iNOS、3-NT、CYP2E1、COX2、p-JNK、p-ERK、p-p38、p-IκB-α及p-NF-κB抗体标记，室温下孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（TBST）洗3次，二抗孵育2 h，再用TBST洗3次，最后用高效化学发光液（ECL）显色，利用ECL Plus蛋白质印迹检测系统拍照记录并分析。以上操作重复3次。

2.6 统计分析

数据均以平均值±标准差表示，通过SPSS16.0处理分析数据，组间样本比较采用t检验，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 鞣花酸对UC小鼠结肠和肝脏的影响

鞣花酸对UC小鼠结肠和肝脏的影响见图1。由图1可见，DSS诱导的UC小鼠结肠明显缩短变窄，均有萎缩、充血、溃疡和坏死等表现，结肠的长度为4.2±0.8 cm，结肠重量为0.4±0.1 g，肝脏重量为0.6±0.2 g，与正常组小鼠（结肠长度为7.5±1.0 cm，结肠重量为0.8±0.1g，肝脏重量为1.7±0.3 g）相比，显著降低（P＜0.05），表明5 %DSS诱导的UC小鼠模型成功建立。给药组小鼠结肠表面光泽、完整，未出现萎缩、充血、溃疡、坏死等，结肠无明显缩短、变窄。结果还显示，给药组小鼠与模型组小鼠相比，结肠的长度（5.9±0.7 cm）、重量（0.6±0.1 g）显著恢复（P＜0.05），差异具有统计学意义。此外，给药组小鼠的肝脏重量为1.2±0.2 g，与模型组小鼠相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明鞣花酸具有改善急性UC的作用。

图1 鞣花酸对溃疡结肠炎小鼠结肠和肝脏的影响（n=10）

3.2 小鼠结肠和肝组织病理学分析结果

病理分析结果见图2、图3。由图2可见，模型组小鼠结肠组织中发现大量炎细胞浸润，隐窝消失、环状细胞减少，黏膜下层出现水肿。给药组小鼠的结肠上皮细胞完整，隐窝、环状细胞损伤、水肿程度较轻。由图3可见，模型组小鼠肝细胞出现大量细胞核破坏和损伤（图3B箭头所示），但给药组小鼠肝脏未发现明显损伤（图3C箭头所示），说明鞣花酸能减轻肠和肝脏组织的炎症程度和组织学损伤。

图2 小鼠结肠组织病理学分析结果（HE染色×200）

图3 小鼠肝脏组织病理学分析结果（HE染色×200）

3.3 血清炎症因子水平

血清炎症因子测定结果见图4。血清中TNF-α，IL-1β，NO高水平表达是急性炎症的典型特征。模型组小鼠血清中TNF-α水平为415±22 ng/L，IL-1β水平为720±30 ng/L，NO水平为 635±20 mol/L，与正常组（TNF-α水平为390±26 ng/L，IL-1β水平为570±50 ng/L，NO水平为550±12 mol/L）相比，均显著增高（P＜0.05）。给药组小鼠的TNF-α水平为370±10 ng/L，IL-1β水平为420±30 ng/L，NO水平为530±20 mol/L，与模型组小鼠比较，显著降低（P＜0.05），说明鞣花酸能抑制血清中炎症因子的表达，这与组织病理学分析结果一致。

图4 血液中炎症因子（TNF-α，IL-1β，NO）表达水平测定结果（n=10）

3.4 抗氧化因子Western blot检测结果

抗氧因子能通过抑制自由基的产生，清除、熄灭活性氧自由基，从而减少基因或蛋白质的氧化损伤。小鼠血清中抗氧化因子（iNOS、3-NT、CYP2E1）的Western blot检测结果见图5。模型组小鼠血清中iNOS（100±4.1）、3-NT（100±6.0）、CYP2E1（10 240±10.0）的表达水平，与正常组（iNOS为25±5.0、3-NT为40±4.1、CYP2E1为23±3.2）相比明显增高（P＜0.01）。给药组小鼠的iNOS（54±4.2）、3-NT（70±4.0）、CYP2E1（53±3.1）的表达水平，与模型组小鼠相比明显被抑制（P＜0.05），说明鞣花酸能抑制抗氧化因子，这与血清中炎症因子分析结果一致。

图5 抗氧化因子（iNOS，3-NT，CYP2E1）Western blot检测结果（n=10）

3.5 抗炎症因子Western blot检测结果

COX2及MAPK信号通路磷酸化激活后转录因子（p-ERK，p-p38，p-IκB-α，p-NF-κB）是主要抗炎症因子，小鼠血清中抗炎症因子的Western blot检测结果见图6。DSS诱导的小鼠血清中COX2（100±5.0）、p-JNK（100±6.1）、p-ERK（100±8.2）、 p-p38（100±4.0）、p-IκB-α（100±3.9）、p-NF-κB（100±8.2）的表达水平与正常组（COX2为41±4.1、p-JNK为44±3.9、p-ERK为62±6.0、p-p38为70±8.1、p-IκB-α为56±5.9、p-NF-κB为25±10.0）相比，均显著增高（P＜0.05）。鞣花酸处理的试验组小鼠的抗炎症因子表达水平（COX2为46±6.0、p-JNK为62±6.0、p-ERK为75±2.1、p-p38为82±5.9、p-IκB-α为63±4.1、p-NF-κB为40±3.0）与模型组小鼠比较，均显著被抑制（P＜0.05），说明鞣花酸能抑制抗氧化因子，这与血清中炎症因子和抗氧化因子水平分析的结果一致。

图6 抗炎症因子Western blot检测结果（n=10）

4 讨论

本研究选取天然酚类──鞣花酸，探讨其对5 %DSS诱导的UC小鼠的影响，发现鞣花酸对UC小鼠的结肠和肝脏组织具有改善作用，能缓解炎症程度和组织学损伤，其作用与MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎症信号通路与CYP2E1/iNOS/3-NT氧化应激通路有关。

4.1 鞣花酸抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎症信号通路

MAPK信号通路的主要枢纽包括p-38、JNK、ERK等，通过调节关键枢纽, 介导细胞炎症反应、细胞增殖、凋亡等[7]。其中，磷酸化激活后的JNK（p-JNK）是各种应激原作用中信号传导的关键因子；磷酸化激活后的ERK（p-ERK）是多种炎症反应中的必须因子；磷酸化激活后的p-38（p-p-38）参与细胞炎症和凋亡。故转录因子p-JNK、p-ERK、p-p-38是治疗UC的重要的药物靶点[8]。有研究报道，MAPK下游的核转录因子NF-κB调控多种促炎因子的表达，并参于炎症性肠病[8]，而NF-κB的抑制蛋白IκB是此通路的中间环节。NF-κB和IκB参与急性/慢性炎症、组织纤维化、细胞凋亡等病理生理过程，还能调控促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等的转录水平[9]。其中，TNF-α是炎症反应相关重要启动细胞因子，在UC发生时其高表达可加重炎症反应，诱导病理性损伤的增大。IL-1β是由巨噬细胞和单核细胞分泌，介导机体炎症调控与免疫应答，其高表达与UC炎症的发生也有密切关系[10]。Yu等[11]报道有效抑制NF-kB和MAPK信号通路，便会减少促炎细胞因子的产生。本研究的结果显示鞣花酸显著降低模型小鼠血清TNF-α、IL-1β释放（P＜0.05），认为这可能与MAPK/IκB-α/NF-κB通路的抑制有关。

此外，NF-κB能下游调控COX2的转录，导致COX2表达增多，从而促进多种炎性递质产生，扩大和持续炎症发生[12]。本研究发现，模型组动物结肠组织中COX2、IκB-α、NF-κB、p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表达显著高于正常组（P＜ 0.05），说明该炎症细胞因子群的高表达与DSS诱导的UC发生发展密切相关。上述细胞因子属于炎症信号通路的关键因子，因此，鞣花酸可能是基于MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎症通道发挥抗炎作用，从而显著减少促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的释放。

4.2 鞣花酸抑制CYP2E1/iNOS/NO/3-NT氧化通路

疾病条件下，氧化应激的增加可增加炎性细胞因子释放，而炎性细胞因子的增加可刺激自由基的产生，从而诱导氧化应激。有研究表明，CYP2E1在脂肪酸氧化过程中产生过量的ROS[13], 诱导iNOS的生成，进而调节血红素氧合酶1（HO-1）表达[14]。而超氧化物存在下形成的NO高表达，通过与蛋白质上的酪氨酸残基反应形成3-NT，导致包括非酒精性脂肪性肝病或阻塞性肺病等高氧性组织损伤。UC患者发炎黏膜中的管腔隐窝细胞、中性粒细胞和单核细胞中的 3-NT 表达也增加[15]。本研究结果发现，模型组动物血液和结肠组织中CYP2E1、iNOS、NO、3-NT的表达显著均高于正常组（P＜0.05），说明CYP2E1/iNOS/NO/3-NT通路与DSS诱导的UC发生密切相关。鞣花酸对UC小鼠模型结肠组织中过量表达的CYP2E1、iNOS、NO、3-NT均有下调作用（P＜0.05）, 表明鞣花酸改善UC可能是基于对CYP2E1/iNOS/3-NT抗氧化应激通路的抑制。本研究的病理组织形态学结果表明，鞣花酸显著改善了DSS诱导的UC小鼠的肠和肝脏组织的炎症程度和组织学损伤。

综上，本研究发现鞣花酸抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX及CYP2E1/iNOS/3-NT通路，从而显著减少TNF-α、IL-1β、NO释放，进而产生改善UC的作用。但抗氧抗炎涉及信号通路较多，本研究还有待于更深入探索。