肿瘤相关性成纤维细胞高表达LncRNA ZEB1-AS1促进肺腺癌血管生成的功能机制

陈 昊，方攀奇，刘桐言，马志飞，韩忱成，王思炜，尹 荣，许 林

0 引 言

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤。近年来，肺腺癌的发病率不断上升，已成为肺癌最常见的病理亚型之一[1]。长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是一类长度超过200 nt的RNA分子[2]。LncRNA不仅能够直接促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，而且能够促进血管形成，从而帮助肺腺癌细胞侵袭和转移。研究表明，LincRNA-p21通过血管生成的调控影响非小细胞肺癌的预后[3]。实体肿瘤中，除肿瘤细胞，肿瘤间质细胞如肿瘤相关性成纤维细胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)中转录组的差异性改变往往也能对肿瘤的恶性进展起到关键作用。有研究表明，CAFs中高表达Lnc003875通过吸附miRNA-363促进胎盘滋养层细胞瘤的血管生成和肿瘤转移[4]。LncRNA ZEB1-AS1是本课题组筛选出的在肺腺癌CAFs高表达的LncRNA。研究显示，成纤维细胞可以通过ZEB1-AS1/miR-200b-3p/ZEB1信号轴形成纤维化微环境从而抑制肿瘤凋亡和促进肿瘤转移[5]。然而，关于ZEB1-AS1对肺腺癌血管生成方面的作用和机制尚未明确。本研究通过检测LncRNA ZEB1-AS1在肺腺癌组织与配对癌旁正常组织以及肺腺癌细胞系CAFs和NFs中的表达差异，并检测小干扰RNA沉默ZEB1-AS1后对血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)血管形成和肺腺癌转移对的影响，以期为肺腺癌的分子诊断和靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床标本采集回顾性分析2019年1月至2021年6月之间在我院胸外科接受肿瘤切除手术，并经病理诊断为肺腺癌初治患者标本及配对癌旁正常组织各15例。所有患者术前均未接受过放疗或者化疗。本研究已获得南京医科大学伦理委员会批准[批准号：2018(107)]，所有患者均知情同意。

1.2材料及试剂人肺腺癌细胞株A549、H1299、HCC827、PC9、H1975、H661以及正常人肺上皮细胞系HBE均购于中科院上海细胞库。LncRNA ZEB1-AS1、VEGFA、GAPDH引物序列由南京锐真生物有限公司合成；has-miR-505-3p加尾引物序列、miR-505-3p mimic，miR-505-3p inhibitor及其阴性对照mimic NC和特异性靶向miR-505-3p的siRNA及其阴性对照NC由南京锐博生物有限公司合成；人体组织解离试剂盒、预包被的VEGFA、EGF细胞因子ELISA试剂盒由南京福麦斯生物有限公司提供；α-SMA荧光组织免疫化学染色和RNA荧光原位杂交实验由武汉塞维尔生物科技有限公司实施；PCR及辉光型双荧光素酶报告基因试剂盒由诺唯赞生物科技有限公司提供。

1.3人CAFs分离及培养将15对新鲜切取的肺腺癌组织及其配对癌旁组织置于组织保存液中。采用美天旎人体组织解离试剂盒配成合适的解离体系，用无菌组织剪将组织剪成1～2mm组织块并解离30 min。将组织悬液通过70 μm细胞筛获得单细胞悬液，离心后用含10% Gibco胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，次日更换新鲜培养基。

1.4细胞培养取出液氮中冻存的人肺腺癌细胞株及正常人肺上皮细胞株，培养于高糖DMEM培养基中，10%胎牛血清(Gibico)，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，细胞生长至汇合度达80%时，消化传代。

1.5RT-PCR依据试剂盒(Vazyme)说明书进行实验，PCR结果获得的各组循环阈值(CT值)，以GAPDH为内参，计算2-ΔΔCt值。ZEB1-AS1、miR-505-3p、GAPDH引物序列见表1。

1.6细胞转染选择细胞汇合度70%，生长状态良好的CAFs细胞，按照Lipofectamine 3000说明书分别转染si ZEB1-AS1和NC，转染24 h后收集细胞，Trizol法提取总RNA, PCR检测转染效率。Si ZEB1-AS1序列及NC序列见表1。

1.7冰冻切片荧光探针原位杂交和免疫荧光实验组织切取后经4%多聚甲醛固定12 h以上，经蔗糖溶液脱水，冰冻切片后置于固定液中固定10 min，PBS摇洗3遍，蛋白酶K消化，预杂交液37 ℃孵育1 h，RNA探针杂交过夜，分别用2×SCC，1×SCC和0.5×SCC洗涤，滴加血清室温封闭30 min，孵育α-SMA一抗(50513SF，CST)4 ℃过夜，室温孵育二抗50 min，DAPI避光复染细胞核8 min后置于尼康正置显微镜下观察拍照。

1.8血管生成实验将冰上融化的Matrigel胶垂直滴入ibidi血管生成载玻片内孔中并置于培养箱中凝固。将不同处理组的HUVEC细胞稀释成2×105mL的细胞悬液，每孔加入50 μL细胞悬液并定时采集血管生成图像，对其成管长度、覆盖面积、成环数、结点数进行测量、记录和统计分析。

1.9共培养Transwell、Matrigel侵袭迁移实验用含10%血清的培养基铺约4×104个不同处理的HUVEC细胞至24孔板中，0.5 h后至细胞贴壁，将A549细胞用不完全培养基稀释并接种于24孔板中Transwell、Matrigel的小室中，每小室细胞数4×104个。24、48 h后分别收集Transwell和Matrigel小室，使用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min并用酒精棉轻轻擦去未穿过的细胞，操作完成后将小室置于倒置荧光显微镜下，观察视野中穿出的蓝色细胞，计数并拍照。

1.10酶联免疫吸附实验收集转染NC或Si ZEB1-AS1的CAFs细胞上清并采用福麦斯生物科技有限公司预包被VEGFA、EGF抗体的ELISA试剂盒(FMS-ELH046、FMS-ELH050，福麦斯生物)进行上清因子检测，加一定待检测样品于样品孔中并37 ℃孵育1 h，洗涤后加入酶标抗体37 ℃孵育1 h，加底物显色液37 ℃孵育35 min，终止反应并置于分光光度计中读取光度值，对照标准品获得上清中细胞因子的浓度。

1.11双荧光素酶报告基因实验种植合适密度的CAFs细胞置于薄底不透光96孔细胞平板中，转染相应的VEGFA 3′UTR突变或者野生型质粒和(或)siRNA以及miRNA mimic或inhibitor，24 h后加入等体积诺唯赞Firefly Luciferase Buffer，室温避光孵育10 min并在奥德赛酶标仪中读取萤火虫荧光值(F)，加入等体积Stop Buffer，室温避光孵育10 min并读取海肾荧光值(R)，计算F/R并比较不同转染的差异。

1.12SDS-PAGE蛋白免疫印迹实验将转染后的CAFs置于冰上制成蛋白样品，BCA法矫正蛋白浓度后将样品加入聚丙烯酰胺凝胶上样槽中125 V、80 min电泳。采用金斯瑞快速湿转仪(V518419)将蛋白印迹转移至PVDF膜上，4 ℃孵育VEGFA(WL00009b，万类生物)，β-actin(3700T，CST)一抗过夜，室温孵育对应的荧光二抗2 h，置于奥德赛扫膜仪上曝光。

表 1 RT-PCR和小干扰RNA序列

2 结 果

2.1 LncRNA ZEB1-AS1在肺腺癌CAFs中特异性高表达PCR检测结果显示，肿瘤组织中ZEB1-AS1的相对表达水平为(24.89±19.11)，较癌旁组织(7.09±6.95)明显上升(t=4.46，P=0.0005)，见图1a。进一步检测该15例CAFs及其配对NFs中ZEB1-AS1的表达水平，结合常见的人源肺腺癌细胞系A549、H1299、HCC827、PC9、H1975、H661以及正常人肺上皮细胞系HBE发现，ZEB1-AS1在肺腺癌细胞系及肺上皮细胞中低表达，在CAFs中高表达，见图1b；且与NFs相比，ZEB1-AS1在CAFs中表达上调(t=4.90，P=0.0002)，见图1c。构建ZEB1-AS1的Fish探针对石蜡包埋的肺腺癌组织连续切片行免疫染色，并对CAF的特征指标α-SMA行免疫组化发现，ZEB1-AS1与α-SMA呈明显的共定位，见图1d。

a：ZEB1-AS1在肿瘤和癌旁组织中的表达比较；b：ZEB1-AS1在肺腺癌细胞系，人肺上皮细胞及成纤维细胞中的表达比较；c：ZEB1-AS1在CAFs和NFs中的表达比较；d：冰冻肺腺癌组织切片α-SMA免疫荧光(绿色)和ZEB1-AS1 RNA探针原位杂交(红色)共定位的代表图

2.2沉默LncRNA ZEB1-AS1抑制HUVEC血管生成和肺腺癌细胞系转移结果显示在CAFs中，转染si ZEB1-AS1组后ZEB1-AS1的表达水平明显低于NC组(P<0.05)，见图2a。与NC组相比，si ZEB1-AS1组CAFs促进HUVEC血管生成的小管长度、成环数、细胞覆盖面积和结点均明显减少(P<0.05)，见图2b。相较于NC组，与si ZEB1-AS1组CAFs共培养的HUVEC能明显减少对A549细胞侵袭转移的促进作用(P=0.0002)，见图2c。单纯将转染NC或者si ZEB1-AS1的CAFs置于下室或者用转染后的细胞上清直接培养A549细胞，2组A549的侵袭、迁移情况差异无统计学意义(P>0.05)。

与NC组相比，si ZEB1-AS1后的CAFs上清中的VEGFA表达水平明显下降(P=0.0005)，而其余因子差异无统计学意义(P=0.7138)，见图2d。与NC组相比，CAFs中沉默ZEB1-AS1后，VEGFA的mRNA和蛋白水平均明显下降(P<0.0001)，见图2e-f。

a：si ZEB1-AS1的转染效率；b：血管分支数目及血管长度统计；c：HUVEC共培养的A549 Transwell和Matrigel侵袭迁移细胞数；d：ELISA富集的NC和Si ZEB1-AS1 CAFs上清中细胞因子VEGFA的浓度差异；e-f：CAFs中沉默ZEB1-AS1后VEGFA的mRNA和蛋白水平变化

2.3LncRNA ZEB1-AS1通过海绵吸附miR-505-5p促进VEGFA的表达通过miRNA结合预测网站Starbase发现与ZEB1-AS1结合的miRNA 65条，与VEGFA结合的miRNA 302条，取交集共得到37条miRNAs。进一步结合miRactDB、TargetScan、miRBase等网站，选取has-miR-505-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p进一步研究，见图3a。针对上述miRNAs设计特异性的加尾引物，实时荧光PCR检测发现与NC组相比，转染si ZEB1-AS1的CAFs中miR-505-3p的表达水平明显上升(P<0.000 1),见图3b。进一步用miRNA inhibitor抑制CAFs中的miR-505-3p，PCR和WB实验发现VEGFA的mRNA和蛋白水平均明显上升(P<0.000 1、P=0.002)，见图3c-d。在VEGFA野生型CAFs中，转染si ZEB1-AS1的CAFs比NC组的萤火虫荧光素酶活性明显降低(t=5.99，P=0.003 9)，见图3e；且转染miR-505-3p inhibitor的CAFs比inhibitor NC组的萤火虫荧光素酶活性明显升高(t=21.85，P<0.000 1)，见图3f；而在VEGFA突变型CAFs中，NC组和si ZEB1-AS1，inhibitor NC和miR-505-3p inhibitor组的CAFs萤火虫荧光素差异无统计学意义(t=0.595，P=0.583 6；t=0.05，P=0.958 8，见图3e-f。在野生型CAFs中，沉默ZEB1-AS1能够抵消miR-505-3p inhibitor促进萤火虫荧光素的表达(t=18.12，P<0.000 1；t=17.50，P<0.0001)，见图3g。在CAFs中沉默ZEB1-AS1可以明显抵消抑制miR-505-3p后促进HUVEC血管形成的作用(P=0.000 8)，见图3h。

2.4LncRNA ZEB1-SA1表达水平提示肺腺癌患者的不良预后通过现有组织cDNA行实时荧光PCR发现，ZEB1-AS1和miR-505-3p存在明显的负相关(r2=0.4337，P=0.0076)，见图4a；而和VEGFA存在明显的正相关(r2=0.2830，P=0.0412)，见图4b。与低表达相比，高表达ZEB1-AS1和VEGFA均提示患者的总体生存期缩短(cutoff=50%，P=0.0092；cutoff=25%，P=0.0032)，预后不良，见图4c-h。由此可见，LncRNA ZEB1-AS1可能是一条可以评估患者生存的预后指标和潜在的临床治疗靶点。

a：网站预测ZEB1-AS1结合的潜在miRNAs；b：PCR验证沉默CAF中ZEB1-AS1后miRNAs的表达；c-d：抑制CAFs中miR-505-3p后，VEGFA的mRNA和蛋白表达水平；e-f：预测ZEB1-AS1竞争性结合miR-505-3p的双荧光素酶报告基因实验；g-h：拯救实验的荧光素酶报告基因实验及HUVEC血管生成表型

a-b：LncRNA ZEB1-AS1与miR-505-3p以及VEGFA的相关性分析；c-d：TCGA公共数据库中，ZEB1-AS1和VEGFA的预后分析

3 讨 论

LncRNA在肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、微环境重塑等多方面发挥着重要的生物学作用。有些差异性lncRNAs仅仅存在于非肿瘤细胞中[2, 6-7]。LncRNA ZEB1-AS1是一条反义lncRNA，位于染色体带10p11.22，含有2538个碱基。Wu等[8]研究发现，LncRNA ZEB1-AS1可以通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进甲状腺癌的进展。在本研究中，我们首先比较了ZEB1-AS1在肺腺癌组织及癌旁正常组织，CAFs及NFs 中的表达差异，并对ZEB1-AS1在血管生成和对肺腺癌细胞侵袭转移方面的功能进行初步探究。结果发现，ZEB1-AS1是一条CAFs特异性高表达的lncRNA。CAFs高表达的ZEB1-AS1能够在新生血管分支数目和血管长度等方面均促进HUVEC的血管生成并进而促进A549的侵袭和转移。

血管内皮生长因子VEGFA是血管生成的关键细胞因子并在肺腺癌的进展中起到关键作用[9-10]。有研究发现，VEGFA可以导致肿瘤病理性血管增生和增加PD-L1的表达来抑制肿瘤免疫[11]。本研究发现沉默ZEB1-AS1 CAFs上清中VEGFA的分泌水平，CAFs中VEGFA的mRNA和蛋白水平均明显降低，提示ZEB1通过调控VEGFA的转录来调控HUVEC血管生成。大量研究发现lncRNA可通过绑定蛋白或竞争性结合miRNA形成“分子海绵”发挥生物学功能, 如lncRNA JPX可通过miR-33a-5p/Twist1轴激活Wnt/β-catenin促进肺癌侵袭转移[12]。通过Starbase等网站，PCR和WB验证，本研究确定了一条可能和ZEB1-AS1和VEGFA结合的miRNA miR-505-3p。双荧光素酶报告基因实验以及交叉拯救的血管生成实验显示，ZEB1-AS1作为ceRNA来调控VEGFA的转录从而影响VEGFA的蛋白合成和分泌，并进一步调控HUVEC的血管生成。通过江苏省肿瘤医院获得的肺腺癌组织cDNA和TCGA数据库研究发现，ZEB1-AS1的表达与肺腺癌患者的预后相关，ZEB1-AS1可能是肺腺癌潜在的预后标志物。

综上所述，LncRNA ZEB1-AS1是一条CAFs特异性高表达的lncRNA，且高表达的ZEB1-AS1能够促进HUVEC血管生成并进而促进肺腺癌的侵袭转移。初步探究其机制发现，ZEB1-AS1通过miR-505-3p/VEGFA轴促进肺腺癌病理血管生成和侵袭转移。研究表明肿瘤微环境细胞的lncRNA可以通过促进细胞本身分泌炎症因子、血管活性物质等促进肿瘤的侵袭和转移[13-14]。也有研究显示，CAFs可以直接通过外泌体的形式肿瘤细胞传递lncRNA[15]。向本研究的初步探索给CAFs和肿瘤血管细胞之间互作提供了新的思路，关于ZEB1-AS1如何具体调控血管生成的具体机制以及和肿瘤细胞间串扰的过程需要进一步的深入研究。同时，AGO2的RIP结合实验，大样本组织芯片和高通量测序技术可以丰富研究结果，明确ZEB1-AS1在肺腺癌发生、发展中的作用机制，为肺腺癌的分子诊断和治疗提供参考。