1个脆性X综合征家系的FMR1基因CGG重复及甲基化状态分析*

钟青燕，刘晓丽，罗世强，袁德健，王敬仁，王秋华b，黄钧b，严提珍（柳州市妇幼保健院 ＆ 广西科技大学附属妇产医院、儿童医院 .医学遗传科，b.柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，c.柳州市生殖与遗传研究所，广西柳州 545001）

脆性 X 综合征（fragile X syndrome，FXS）作为最常见的X连锁的智力低下综合征，是发病率仅次于唐氏综合征的第二大智力低下疾病［1］，同时也是孤独症谱系障碍常见的遗传因素。人群发病率男性约 1／4 000，女性约为 1／8 000［2-3］。约 99%的脆性X综合征患者发病的分子机制是由于FMR1 基因5′端非编码区的三核苷酸重复序列CGG过度扩增引起其上游约250 bp处CpG岛发生不同程度的异常甲基化，从而抑制FMR1 基因正常转录，造成FMR1不表达或低表达，进而引起一系列的临床症状。绝大部分男性全突变患者有典型脆性X 综合征的临床表现，也有30%～50%女性全突变携带者表现为轻重程度不等的智力低下，严重程度明显低于男性［4］。目前脆性X 综合征的相关研究更多的是关注患者的CGG 重复数或甲基化情况，对甲基化程度和表型关系研究的较少，本研究应用PCR微流控芯片毛细管电泳联合MS-MLPA技术对脆性X综合征家系进行CGG重复序列和甲基化状态分析，同时探讨甲基化程度和临床表型的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2017年8月于柳州市妇幼保健院医学遗传科遗传咨询的1 个脆性X 综合征家系，5代共22人（家系图谱见图1）。先证者（Ⅳ4）为男性，21岁，表现为特殊面容（长脸、大耳朵）、智力障碍、自闭症、社交障碍等临床表现，另外3 名男性患者（Ⅳ5、Ⅳ6 和Ⅳ9）和先证者有相似的临床症状，其余家系成员未发现有类似临床表现（表1）。本研究经柳州市妇幼保健院医学伦理审查委员会审批（批准文号：20160227042），所有研究对象或家属均知情同意。

图1 脆性X综合征家系图

1.2 样本采集与处理 采集先证者及家系成员外周血2～3 mL于EDTA-K2真空抗凝管中，颠倒混匀用于DNA提取及PCR扩增。

1.3 主要仪器及试剂 Chemagic360 全自动提取仪、LabChip FGX微流控毛细管电泳仪、FMR1 基因检测试剂盒（PCR 微流控芯片毛细管电泳法）、核酸提取试剂盒（苏州新波公司），3500Dx 遗传分析仪（美国ABI公司）。SALSA MLPA ME029 试剂盒（荷兰 MHC-Holland 公司），QIAampDSP 全血 DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）。

1.4 方法

1.4.1 DNA 样本准备 使用核酸提取试剂盒，在Chemagic360全自动提取仪上提取受试者外周血基因组DNA，提取的基因组DNA用于PCR反应。使用QIAampDSP 全血DNA 提取试剂盒提取基因组DNA用于Southern 印记杂交。所有实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.2 PCR 微流控芯片毛细管电泳技术 使用FMR1基因检测试剂盒（PCR微流控芯片毛细管电泳法）进行FMR1基因检测，对受试者基因组DNA进行 PCR 扩增，PCR 反应体系共 20 μL，包括 FX反应液 15 μL，FX 稀释液 3.8 μL，FX 聚合酶0.2 μL，DNA 模板 1 μL。反应条件：95 ℃ 预变性5 min，98 ℃变性 35 s，61 ℃ 退火 35 s，72 ℃ 延伸4 min，共 25 个循环，72 ℃终延伸 10 min。将 PCR产物进行核酸纯化，具体操作步骤参见试剂盒说明书。纯化后的PCR产物在LabChip FGX 微流控毛细管电泳仪上进行PCR产物片段大小分析。将所得的样本核酸片段大小等信息导入FMR1 基因检测报告软件，根据软件说明书对数据自动进行分析和拟合，计算出CGG 重复数。本研究同时采用已知重复数的参考样本（质控DNA，5 个不同CGG重复数的 DNA 片段，29／43／56／100／375 CGG 重复数）构建标准曲线，测定样本核酸片段大小通过标准曲线换算得到更高精度的CGG重复数。CGG重复数按照美国人类遗传学学会（American College of Medical Genetics，ACMG）指南［5］对基因型进行分型：正常型（CGG 重复次数＜45）；前突变型（CGG重复次数为55 ～200）以及全突变型（CGG 重复次数＞200）。

1.4.3 MS-MLPA 检测 采用 SALSA MLPA ME029试剂盒检测样本FMR1 基因缺失和重复及FMR1基因上游CpG岛甲基化状态。具体步骤按照试剂盒说明书操作。参照文献［6］，用3500Dx遗传分析仪进行产物分析，原始数据通过Coffalyzer.Net软件（荷兰MRC-Holland 公司）进行数据归一化分析。将FMR1基因7个甲基化特异性探针比值的平均值作为甲基化比值。男性甲基化比值为0，表明不存在甲基化，甲基化比值＞0.64表明存在异常甲基化。

1.4.4 Southern 印记检测 所有全突变阳性样本均送到中南大学生命科学院遗传研究中心进行Southern 印记杂交验证［7］。

1.5 统计学分析 采用SPSS 24.0 统计学软件进行数据统计分析。组间比较采用t 检验，检验水准α ＝0.05，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR微流控芯片毛细管电泳结果 22个家系成员中检出正常型9例（1男，8女），检出女性前突变携带者8例，其FMR1 基因CGG 重复数在100 ～128 之间，其中 1 例 （12.5%）卵巢早衰，5 例（62.5%）女性前突变携带者出现月经紊乱，明显高于正常型（25%）；检出脆性X 综合征男性患者4例，全突变女性携带者1 例，均由前突变携带者母亲动态突变传递而来。22个家系成员的CGG重复数见表1、部分家系成员PCR微流控芯片毛细管电泳图谱见图2。

图2 PCR微流控芯片毛细管电泳检测FMR1基因电泳图

2.2 MS-MLPA检测结果 22例家系成员MS-MLPA分析，均未发现FMR1基因缺失和重复。男性正常型甲基化比值为0，女性正常型和前突变携带者甲基化比值范围分别为 0.25 ～0.48（中位数 0.33）和0.33～0.46（中位数 0.38），两组差异无统计学意义（t＝ 0.095，P＞0.05）；1 例女性全突变携带者（Ⅳ：16）甲基化比值为0.52，高于正常型和前突变携带者中位数（0.33，0.38）；4 例男性全突变患者（Ⅳ：4、Ⅳ：5、Ⅳ：6、Ⅳ：9）CpG 岛为异常甲基化状态，甲基化比值均＞0.64（表1）。部分图谱见图3。

图3 MS-MLPA检测FMR1基因缺失、重复和甲基化状态的图谱

表1 22个家系成员的CGG重复数，MS-MLPA结果及临床表现

续表1

2.3 Southern印迹杂交结果 4例男性脆性X综合征患者均出现＞5.8 Kb条带（男性全突变型），1例女性全突变携带者出现 2.8 Kb、5.2 Kb 和＞5.8 Kb 条带（女性全突变型）。

3 讨论

FMR1基因CGG 重复数的动态突变递增仅遵循母源传递，父源传递时一般不发生大范围递增反而缩减，Mulley等［8］报道1例中度智力低下的脆性X综合征（FXS）男性患者生育的女儿表现为前突变型，Kambouris 等［9］发现 1 例前突变和全突变嵌合男性生育的女儿也表现为前突变型，其CGG 重复数跟父亲一样，Willems 等［10］发现 1 例表型正常的全突变甲基化嵌合男性其精子CGG重复数与女儿相同，段然慧等［11］通过对 2 例 FXS 男性胎儿（1例全突变、1 例全突变和前突变嵌合）睾丸组织进行CGG重复数及甲基化水平检测，进一步证实父源CGG重复数在子代传递呈现缩减渐进过程。本研究的家系中Ⅲ代的女性成员均为前突变携带者，CGG重复数在100～128 之间，其母亲（Ⅱ：2 和Ⅱ：4）为正常型，因父亲已故，根据咨询者反馈其父亲临床表现无特殊，推测前突变携带者的父亲可能表现为前突变，父亲CGG 重复传给其女儿时发生了较小的递增或保持一致。

前突变CpG岛一般不发生甲基化，FMR1 基因可以正常地转录，具有相对正常的蛋白质水平，不表现出脆性X综合征临床症状，但是可能会与老年性震颤、共济失调和卵巢早衰、卵巢功能不全等发生相关。脆性X相关震颤／共济失调综合征（fragile X-associated tremor／ataxia syndrome，FXTAS）可能是由于过多的RNA结合蛋白的毒性作用引起的一组以神经退行性病变为主的疾病［12-13］。约40%或以上前突变携带者在60岁之后罹患迟发型进行性神经系统疾病——FXTAS，此病好发于男性，年纪越大发病率越高［14］。本研究中的 1 例女性（Ⅱ：2，CGG重复数为29／38）在66 岁开始出现老年性震颤、共济失调，排除了脆性X综合征基因变异，其临床症状的出现可能是其他神经系统病变引发。前突变携带者中有20%罹患卵巢早衰的风险，卵巢早衰的发生可能是由于前突变mRNA 对卵巢组织的毒性积累导致卵泡闭锁或凋亡增加［15］。女性前突变携带者CGG 重复数在55 ～80 之间时，重复数越大，发生卵巢早衰的年龄越小，CGG 重复数大于80时发生卵巢早衰的风险明显增高；然而CGG 重复数大于或等于100 时几乎不再增加卵巢早衰的风险，反而还会下降［15］。本研究中8 例女性前突变携带者的CGG重复数均大于或等于100，只有1例（Ⅲ：9）出现卵巢早衰，在 40 岁绝经，发生率为12.5%，这可能与其CGG重复数不属于卵巢早衰的高发区间有关；另外有5例（62.5%）女性前突变携带者出现月经紊乱，高于正常型女性，可能跟前突变mRNA毒性作用有关系，其机制有待进一步研究。

本研究采用MS-MLPA 技术进行甲基化分析，女性正常型和前突变携带者甲基化比值范围为0.25～0.48 和 0.33 ～ 0.46，两组差异无统计学意义（t＝0.095，P＞0.05），1 例女性全突变携带者甲基化比值为 0.52，高于女性正常型和前突变型均值（0.33，0.38），其未出现脆性 X 综合征相关的临床症状。由于存在无活性、甲基化的X 染色体，在正常型和全突变型之间产生重叠的峰值比率，女性样本MS-MLPA分析时得不到可靠的结果，因此，女性阳性样本需采用Southern 印迹杂交法结合PCR 微流控芯片毛细管电泳进行综合分析。4 例男性全突变患者甲基化比值均＞0.64，为高度异常甲基化状态，其中2例表现为中度智力障碍，2例为重度智力障碍，两组患者的甲基化比值差异无统计学意义（t＝0.58，P＞0.05），提示男性患者的临床表型和甲基化程度有关，但非正相关。Nobile 等［16］发现DNA甲基化不是调节FMR1表达的唯一因素，胞嘧啶甲基化、组蛋白修饰、染色质重组、RNA转录的作用也可影响FMR1基因转录调控。

通过CGG 重复数检测和甲基化分析，为脆性X综合征家系成员提供准确全面的分子诊断，男性患者临床表型和甲基化程度相关。前突变和全突变女性的FMR1基因CGG 重复数会发生动态突变递增传给子代，有生育脆性X 综合征患儿的风险。因此，在婚前、孕前进行遗传咨询和基因检测，若是女性携带者，可通过产前诊断或胚胎植入前遗传学检测技术避免患儿的出生。此外，女性携带者有卵巢早衰的风险，应提供风险评估，必要时提前完成生育计划。