尿液外泌体长链非编码 RNA MALAT1 和HIF1A-AS2对膀胱癌诊断的价值*

高娟，王青，王云杰，马梦影，王科勇，李卓（西安医学院第一附属医院检验科，西安 710077）

研究发现，外泌体（exosome）长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）作为潜在的肿瘤标志物对癌症的早期诊断及预后具有重要意义［1］。LncRNA人肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis-as-sociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）在肾 癌［2］、肝 细 胞 癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）［3］等肿瘤中存在异常过表达的现象，并能作为细胞迁移相关基因、周期调控相关基因的转录调控因子，促进肿瘤的增殖及转移。缺氧诱导因子1α 反义 RNA2（hypoxia-inducible factor 1 alpha antisense RNA 2，HIF1A-AS2）是目前研究较多的一种与肿瘤密切相关的RNA，这类基因沉默后可以抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，诱导细胞凋亡［4］。目前，LncRNA MALAT1和HIF1A-AS2在膀胱癌中的作用机制及调控机理受到越来越多的关注，由于膀胱癌患者尿液的易得性，尿液中获取新型诊断标志物具有良好的应用前景。因此，本研究通过检测尿液外泌体中LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 的表达水平，旨在探讨该两项指标在诊断膀胱癌中的临床价值和意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选择2019年1月至2020年12月于西安医学院第一附属医院泌尿科就诊的膀胱癌患者40例，其中男性35例，女性5 例，年龄40 ～78岁，中位年龄59岁。纳入标准：（1）各研究对象均经手术病理或膀胱镜活检确诊［5］；（2）无放、化疗等抗癌治疗史。排除标准：（1）合并其他心、肺、肝、肾脏功能不全者；（2）合并有心脏病、糖尿病、高血压、精神障碍、器官衰竭、免疫疾病和创伤性疾病的患者；（3）合并其他系统肿瘤者。肿瘤分级，TNM分期采用WHO 分期标准［5］。同期收集泌尿科就诊的膀胱良性疾病组患者40 例，其中男性30 例，女性10例，年龄30 ～80 岁，中位年龄55 岁。纳入标准：（1）均经泌尿科医师临床确诊；（2）患有膀胱炎症、膀胱结核、膀胱血管破裂、膀胱息肉、膀胱肌肉收缩无力等膀胱良性疾病的患者。排除标准：（1）合并其他心、肺、肝、肾脏功能不全者；（2）合并有心脏病、糖尿病、高血压、精神障碍、器官衰竭、免疫疾病和创伤性疾病的患者；（3）合并其他肿瘤者。同期收集体检中心体检健康者40例作为健康人对照组，其中男性 32 例，女性 8 例，年龄38～70岁，中位年龄54 岁。

1.2 试剂与仪器 外泌体RNA 提取试剂盒（德国Qiagen 公司），LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（江苏麦莎生物科技公司）。Multiskan FC 型酶标仪（上海赛默飞世尔仪器公司）。

1.3 标本收集 用无菌管收集上述膀胱癌患者、膀胱良性疾病患者和健康人的晨起清洁中段新鲜（1 h 以内）尿液 100 mL。3 000×g 离心 20 min，留取上清液置于－80 ℃保存。

1.4 方法

1.4.1 尿液外泌体 RNA 提取 按照外泌体 RNA提取试剂盒说明书提取尿液外泌体。步骤：样本于4 ℃、10 000×g离心 2 次，每次 30 min，取上清液至新的Ep管中，加入0.5倍体积的PBS稀释，再加入0.05倍体积蛋白酶K溶液，37 ℃温育15 min；然后加入0.3 倍总体积的外泌体分离试剂，4 ℃温育2 h，10 000×g离心20 min，取沉淀即为外泌体。

1.4.2 western blot 法鉴定特异性标志蛋白 CD63和CD81 提取外泌体和对照（PBS）组总蛋白，经12% SDS-PAGE 分离后，电转移至 PVDF 膜上，采用50 g／L 脱脂奶粉封闭 2 h，分别加入 CD63 和CD81 抗体（1 ∶1 000 稀释），4 ℃温育过夜；分别加入 HRP 标记的 IgG（1 ∶2 000 稀释），37 ℃温育 1 h；采用增强化学发光显色系统显色，Quantity one 软件定量，以CD63／β-actin表示CD63 蛋白的相对表达量，以CD81／β-actin表示CD81 蛋白的相对表达量，试验重复3次。

1.4.3 ELISA 法检测尿液外泌体 LncRNA MALAT1和 HIF1A-AS2 水平 按 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2试剂盒说明书操作，使用Multiskan FC型酶标仪在450 nm 波长处读取吸光度（A 值），以标准物的浓度为横坐标，A 值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算样品的实际浓度。MALAT1 和HIF1A-AS2的参考范围均为：31.25～1 000 pg／mL。

1.5 统计学分析 采用 SPSS 18.0 统计软件进行分析，数据为非正态分布，以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，多个独立样本比较采用 Kruskal wallis H检验，多个独立样本两两比较采用Nemenyi法检验。评估尿液外泌体 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2的最优截断点（cut-off 值），以敏感性为纵坐标，以1－特异性为横坐标，绘制ROC 曲线。评估LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 单独及联合检测对膀胱癌的诊断价值。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌尿液外泌体特异性标志蛋白CD63 和CD81的鉴定 western blot 鉴定结果表明，实验组及对照组尿液外泌体均特异性表达标志蛋白CD63和CD81，且符合外泌体的分子特征，见图1。

图1 western blot 法鉴定膀胱癌患者尿液外泌体蛋白质标志物CD63和CD81

2.2 各组尿液 外 泌体 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2的测定结果分析 结果显示，膀胱癌组、膀胱良性疾病组和健康人对照组MALAT1的表达量 依 次 为 461.29 （400.33，504.64）、399.60（356.85，429.94）和 385.43（354.51，416.75），3 组间差异有统计学意义（H ＝ 20.750，P ＜ 0.05）；HIF1A-AS2在上述3组中的表达水平依次为374.30（331.15，405.46）、340.04（256.41，364.85）和 291.71（256.56，348.34），3 组间差异亦有统计学意义（H ＝22.540，P＜0.05）。

2.3 膀胱癌不同分级、不同分期及不同肿瘤大小尿液外泌体 LncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2 水平比较 根据肿瘤不同分级比较发现，膀胱癌 G1 级组尿液外泌体 LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2 水平与 G2-G3 级组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。根据膀胱癌不同分期的比较发现，Ta 期、T1～T2 期和 T3 ～T4 期 3 组之间尿液外泌体MALAT1和HIF1A-AS2 水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；而肿瘤直径≥3.0 cm 组患者尿液外泌体MALAT1 和 HIF1A-AS2 水平明显高于直径＜3.0 cm组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 不同分级、分期及肿瘤大小膀胱癌患者尿液外泌体LncRNA MALAT1和HIF1A-AS2水平比较

2.4 尿液外泌体 LncRNA MALAT1 和 HIF1A-AS2水平对膀胱癌的诊断价值 以膀胱癌为疾病组，膀胱良性疾病及健康人为对照组，ROC曲线评估各项指标诊断膀胱癌的效能，结果表明，MALAT1 诊断膀胱癌的ROC 曲线下面积（AUCROC）为0.748，敏感性为 75.0%，特异性为 66.25%；HIF1A-AS2 诊断膀胱癌的 AUCROC为 0.757，敏感性为75.0%，特异性为68.75%；MALAT1 和 HIF1A-AS2 联合检测诊断膀胱癌的 AUCROC为 0.820，敏感性为85.0%，特异性为81.25%，均高于两项指标的单独诊断价值，见表2、图2。

图2 尿液外泌体 lncRNA MALAT1 和HIF1A-AS2 诊断膀胱癌的ROC曲线

表2 尿液外泌体LncRNA MALAT1和HIF1A-AS2诊断膀胱癌的效能评价

3 讨论

MALAT1 是一种普遍表达且高度保守的LncRNA，有学者报道，在肿瘤发生时细胞内存在内质网应激（ER）的现象，导致转录因子内质网细胞核信号 1 的表达，激活 ER 激酶信号通路，促进MALAT1 的表达［6］。研究还发现，下调 MALAT1 可促进miR-146b-5p表达，抑制膀胱癌细胞EMT和合成MMP-2，进而发挥抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移的作用［7］。并且MALAT1 高表达与肿瘤患者的不良生存预后有关，可能成为新的肿瘤诊断、治疗靶点［2-3］。本研究结果发现，膀胱癌组尿液外泌体中MALAT1的表达水平均明显高于膀胱良性疾病组和健康人对照组；且与肿瘤的直径大小密切相关，提示MALAT1可能成为诊断膀胱癌的新的生物学标志物。

近年来发现，HIF1A-AS2在多种癌症中均呈异常表达，如在膀胱癌中靶向反义长链非编码RNA HIF1A-AS2可抑制膀胱癌的恶性表型［8］。乳腺癌中HIF1A-AS2 表达异常，可通过靶向miR-548c-3p抑制HIF-1／VEGF 通路，抑制癌细胞的增殖、侵袭和上皮－间质转化（EMT），促进其体外凋亡过程，并与临床病理及预后密切相关，具有作为肿瘤进展和预后的生物标志物的潜质［9］。本实验发现，尿液外泌体中HIF1A-AS2 的表达水平在膀胱癌组均明显高于膀胱良性疾病组和健康人对照组；且与肿瘤的直径大小密切相关，提示HIF1A-AS2在肿瘤中发挥促癌基因作用，参与恶性肿瘤的发生及发展进程。表明HIF1A-AS2可能成为诊断膀胱癌的重要生物学标志物。此外，本实验发现，MALAT1诊断膀胱癌的敏感性为75.0%，特异性为 66.25%；HIF1A-AS2诊断膀胱癌的敏感性为 75.0%，特异性为 68.75%；而MALAT1 和 HIF1A-AS2 联合检测的敏感性为85.0%，特异性为 81.25%，均高于两项指标的单独筛查价值，表明尿液外泌体MALAT1和HIF1A-AS2联合检测具有更高的膀胱癌的诊断价值，有望成为膀胱癌诊断、精准治疗及疗效监测的生物学标志物。后续研究中，笔者将进一步选择更接近临床实际工作的样本，验证尿液中的血红蛋白、胆红素、清蛋白及尿酸等对尿液MALAT1 和HIF1A-AS2 检测的影响程度，并通过选择不同的肿瘤标志物与尿液MALAT1和HIF1A-AS2联合检测，以提高对膀胱癌诊断的准确性［10］。