ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286位点基因多态性与尤文肉瘤患者化疗耐药及肺部感染的关系

柴艳梅，邹龙，柴晓婧（.荆门市第二人民医院检验科，湖北荆门 448000；.荆门市公共检验检测中心，湖北荆门 448000）

尤文肉瘤（Ewing′s sarcoma，EWS）是起源于骨骼或软组织的恶性肿瘤，常见于儿童和青少年［1］。化疗是尤文肉瘤的常见治疗方案，可显著改善尤文肉瘤患者的预后。然而，关于尤文肉瘤化疗耐药和肺部感染的机制尚不清楚。既往研究发现，尤文肉瘤患者的遗传背景如单核苷酸多态性（SNP）等可影响化疗药物在机体内的药物代谢动力学，导致不同基因型患者对化疗药物的反应性不同［2］。文献报道，ATP 结合盒 B 亚家族成员1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）基因的多态性可影响长春新碱的化疗效果［3］。此外，尤文肉瘤患者免疫功能低下，更易发生肺部感染，而肺部感染可进一步加剧肿瘤的进展。因此，预防肺部感染是改善尤文肉瘤患者预后的关键。研究表明，Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）和白细胞介素10（interleukin 10，IL-10）基因多态性与多种感染密切相关，但其与尤文肉瘤化疗患者并发肺部感染关系的报道少见［4］。因此，本研究旨在分析ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和 IL-10 rs1554286位点基因多态性与尤文肉瘤患者化疗耐药及并发肺部感染的关系，以期为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取 2017 年 1 月至 2019 年 1 月荆门市第二人民医院就诊的80例尤文肉瘤患者为研究对象。男 38 例，女 42 例，年龄 （24.34±4.76）岁。诊断依据《尤文肉瘤肿瘤家族（ESFT）临床循证诊疗指南》［5］，纳入标准：（1）MRI 提示 EWS 并经穿刺组织学证实；（2）发生部位在骨盆或下肢。排除标准：（1）转移至中枢神经系统者；（2）存在化疗禁忌者；（3）预计生存期短于3 个月者；（4）身体基础条件差者。化疗方案及耐药与肺部感染的评价：采用伊立替康＋长春新碱化疗方案，以20 mg／m2／d的剂量静脉滴注伊立替康90 min，持续5 d，长春新碱的剂量为在第1天和第8天静脉滴注1.4 mg／m2，化疗持续 14 d。化疗敏感性的评价参见实体肿瘤的疗效评价标准1.1 版，化疗疗效分为完全缓解（CR）16 例、部分缓解（PR）6 例、疾病进展（PD）18例和疾病稳定（SD）40 例。化疗敏感定义为CR＋PR，化疗耐药定义为PD＋SD。肺部感染诊断标准参照国家卫生部《医院感染诊断标准》中相关标准进行判定。本研究经荆门市第二人民医院医学伦理学委员会（No.JMSDERMYY-2016071）审核批准，患者及家属均知情同意。

1.2 试剂和仪器 ABI QuantstudioTMDX定量PCR仪、ABI Ion Proton Torrent二代测序仪基因及Orion紫外可见分光光度计购自美国赛默飞公司，DNA提取试剂盒（G1N70）购自美国Sigma 公司，引物由上海生工公司设计合成。

1.3 标本采集 于各患者化疗前采集晨起空腹静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，用于基因多态性检测。无法及时检测的标本置于－80 ℃保存。

1.4 DNA 提取 按 DNA 提取试剂盒（G1N70）说明书操作提取样本DNA。取DNA 吸光度（A260nm／A280nm）值在 1.8 ～ 2.0 之间，浓度为 5 ～ 15 ng／μL 的样本用于后续试验。

1.5 引物设计及荧光定量 PCR ABCB1、TLR4 和IL-10引物设计参照文献［6-8］。ABCB1 rs10276036基因多态性PCR总反应体系为25 μL，包括反应液23 μL 和模板 DNA 2 μL。TLR4 rs11536889 基因多态性PCR总反应体系为20 μL，包括反应液18 μL和模板 DNA 2 μL。PCR 总反应体系为 20 μL，包括PCR反应液18 μL和模板DNA 2 μL。PCR循环参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共 55 个循环，采用 QuantStudio Design ＆ Analysis 软件分析熔解曲线并进行结果判读。ABCB1 rs10276036位点包括 3 种基因型：CC、CT 和 TT，TLR4 rs11536889 位点包括3种基因型：CC、CT和TT，IL-10 rs1554286位点包括3种基因型：GG、GA和AA。

1.6 统计学分析 采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析，分类变量以率来表示，采用χ2检验分析SNP 和相关指标的关系。计算ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 位点基因型的频率，并分析数据是否符合Hardy-Weinberg 平衡定律。以D′表示连锁不平衡的程度，使用SNPStats（https：／ ／www.snpstats.net）软件在线完成分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和IL-10 rs1554286基因多态性分析结果 80 例尤文肉瘤化疗患者ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 位点分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝ 4.253，P ＞ 0.05），具有群体代表性。ABCB1 rs10276036位点中CC 基因型占比高于CT和 TT 基 因 型 （χ2＝ 93.863，P ＜ 0.001），TLR4 rs11536889位点中GG 基因型占比高于GC 和CC基因型（χ2＝ 60.788，P＜0.001），IL-10 rs1554286 位点中GG 基因型占比高于 GA 和 AA 基因型（χ2＝41.213，P＜0.001），见表 1 和表 2。

表1 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286位点基因型分布

表2 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286位点等位基因分布

2.2 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286基因型与化疗耐药的关系 与CT／TT基因型相比，ABCB1 rs10276036 位点CC 基因型出现化疗耐药的差异具有统计学意义（χ2＝ 4.096，P ＝0.043）。与 GC／CC 基因型相比，TLR4 rs11536889位点GG 基因型出现化疗耐药的差异无统计学意义（χ2＝ 0.696，P ＝ 0.404）。IL-10 rs1554286 位点GG基因型与GA／AA基因型出现化疗耐药相比，其差异无统计学意义（χ2＝0.376，P ＝0.540），见表 3。

表3 ABCB1 rs10276036和TLR4 rs11536889基因型与化疗耐药的关系

2.3 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286 基因型与肺部感染的关系 ABCB1 rs10276036位点CC 基因型与 CT／TT 基因型肺部感染发生率相比，差异无统计学意义（χ2＝0.883，P ＝0.347）。TLR4 rs11536889 位点的 GG 基因型与GC／CC 基因型患者肺部感染发生率相比，差异具有统计学意义 （χ2＝ 4.581，P ＝ 0.032）。IL-10 rs1554286位点的 GG 基因型与 GA／AA 基因型患者肺部感染发生率相比，差异具有统计学意义（χ2＝6.123，P ＝0.013），见表 4。

2.4 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889 和 IL-10 rs1554286 位点之间连锁不平衡分析 利用SNPStats 软 件 对 ABCB1 rs10276036、TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 位点进行连锁不平衡分析。ABCB1 rs10276036和TLR4 rs11536889两位点处于连锁不平衡状态（D′＝ 0.89，P ＜0.05），TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286 也处于连锁不平衡状态（D′＝0.91，P＜0.05），ABCB1 rs10276036和IL-10 rs1554286位点处于连锁不平衡状态（D′＝0.88，P＜0.05）。

3 讨论

ABCB1是具有膜外泵功能的药物转运蛋白，广泛参与药物的药代动力学。ABCB1 基因位点的突变可直接影响长春新碱在体内代谢的过程，进而影响化疗效果［9］。刘珊［10］研究发现，ABCB1 位点发生C／T突变降低了长春新碱化疗对非小细胞肺癌患者的疗效。然而，ABCB1 rs10276036 位点多态性在尤文肉瘤化疗耐药性的作用国内尚未见报道。结合前期文献报道，本研究通过荧光定量PCR 对尤文肉瘤患者ABCB1 rs10276036 位点多态性进行测定，结果发现C基因型突变可引起长春新碱化疗耐药的增加，而CC 基因型更易出现化疗耐药。另有学者在肝细胞肝癌患者中也观察到了CC基因型更易导致化疗耐药［11］。故而笔者推测C 基因型突变致使ABCB活性增强，造成药物排出增多，进而加速了药物在体内的代谢过程，最终导致有效血药浓度下降引起敏感性下降。

探究影响肺部感染的因素对于改善患者的预后具有重要的意义。肺部感染患者多存在体内炎症反应紊乱，研究炎症调控相关基因的多态性是阐明肺部感染发生病理生理机制的切入点。结合前期研究和文献报道，笔者对TLR4和IL-10基因多态性进行了研究。TLR4 是一种跨膜的模式识别受体，病原体与其结合后激活免疫相关通路介导炎症和调节细胞因子，其参与HIV感染、肠道病毒感染、HPV感染和支原体感染等多种感染的发病机制［12］。TLR4 rs11536889位点的多态性可影响机体炎症水平，介导感染的发生。如周国琴等［13］在血液透析患者中证实，TLR4 rs11536889 位点G 突变可引起导管相关性感染增多。本研究还发现TLR4 rs11536889位点GG基因型患者肺部感染发生率为50.94%，GC／CC 型为25.93%。与 GG 基因型相比，GC／CC型患者较少发生肺部感染。分析原因，笔者认为G基因型突变引起TLR4 功能的变化，导致炎症反应紊乱，使得免疫功能下降，最终导致肺部感染的增多。由于炎症反应调控复杂，笔者对涉及炎症反应另一关键分子IL-10进行了研究，IL-10属于TH1炎症反应抑制因子，主要由T 细胞和抗原呈递细胞分泌，广泛参与微生物抗感染的过程。既往文献报道IL-10 rs1554286 位点的多态性与维持性血液透析患者肺部感染具有显著相关性［14］。此外，还有学者发现，IL-10位点的突变也与肺结核的易感性密切相关［15］。但是其在肿瘤患者中并发肺感染的研究较少。本研究发现IL-10 rs1554286 位点GG 基因型患者肺部感染发生率为58.33%，GA／AA型为 28.13%。与 GG 基因型相比，GA／AA型患者较少发生肺部感染。本研究结果提示，IL-10基因多态性可能参与多种肺部感染的过程，并发挥重要的作用。

本研究存在以下不足之处：实验未排除性别和患病时间的差异，可能会造成选择偏倚。其次，笔者未对肺部感染的病原体种类未进行具体分析，特定的基因多态性可能与不同病原体感染相关。综上所述，ABCB1 rs10276036位点的多态性可影响尤文肉瘤患者的化疗耐药，C 等位基因突变可引起更差的化疗效果；TLR4 rs11536889和IL-10 rs1554286位点的多态性则与尤文肉瘤患者并发肺部感染相关，G等位基因突变可增加肺部感染的可能。