UPLC-MS/MS法测定利奈唑胺中的一种基因毒性杂质

2022-08-08李倚天梅芊刘英河南省食品药品检验所郑州450018

中南药学 2022年5期

李倚天，梅芊，刘英（河南省食品药品检验所，郑州 450018）

基因毒性杂质是指能引起DNA 突变、染色体断裂或者DNA 重组的物质，可导致肿瘤的发生[1-2]。基因毒性杂质主要来源于原料合成过程中的起始物料、中间体、试剂及反应副产物，也可在药物贮存中降解产生[3]。近年来，随着各国基因毒性杂质法规的逐步健全和监管要求的日益提高，基因毒性杂质的研究已成为药物质量研究与控制的热点与难点。

利奈唑胺是第一个由人工合成并应用于临床的新型噁唑烷酮类抗菌药，2000年在美国获批上市，2007年进入中国市场[4]。自2000年美国 FDA批准该药物上市以来，利奈唑胺被广泛用于治疗革兰氏阳性球菌引起的感染，包括由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的疑似或确诊院内获得性肺炎、社区获得性肺炎、复杂性皮肤或皮肤软组织感染以及耐万古霉素肠球菌感染等[5]。其合成以（S）-N-[2-（乙酰氧基-3-氯丙基）]乙酰胺（ACPA）为起始物料，过程中用到了S-环氧氯丙烷（ECH）和S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐（结构见图1）[6]。依照欧盟基因毒性杂质指导原则及相关文献，这三者的结构式中均含有基因毒性警示结构[7]，其中 ECH 与ACPA 根据文献报道已采用GC-MS 法进行测定和控制，而S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐暂无方法对其进行控制，因此需要建立合适的方法对其进行测定。考虑到利奈唑胺治疗期为1 ～12 个月，根据人用药品注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization，ICH）M7 指南规定，关于遗传毒性杂质基于毒性学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）的治疗期为1 ～12个月的药品的可接受摄入量为每日 60 µg[8]，S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的限度为15 μg·g-1，限度较低，对测定方法的专属性及灵敏度要求较高，采用常规的液相色谱紫外检测器检测难以实现，因此有必要建立一种准确及灵敏度高的分析方法对其进行控制。液相色谱-质谱联用技术具有灵敏度高、分析速度快、结果准确等特点，能够满足痕量基因毒性杂质的检测要求[9-10]。本文建立了液相色谱-四极杆-离子肼高分辨质谱法分析利奈唑胺中S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的含量，为其质量控制提供参考。

图1 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐化学结构Fig 1 Chemical structure of S-1-amino-3-chloro-2-propanol hydrochloride

1 材料

1.1 仪器

赛默飞Q Exactive Plus 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用仪（美国赛默飞世尔科技公司），XPE205电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 试药

甲醇、乙腈为色谱纯（MERCK 公司），甲酸（Sigma-Aldrich，批号：SHBL0331），水为MillQ 去离子水。S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度：98.0%，批号：F2002149）；利奈唑胺原料（批号：27150501、27150601、27150602、27150603，浙江新塞科药业有限公司；批号：4039190801、4039190802、4039190803、4039191001，河南华润双鹤药业股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 测定条件

色谱条件：采用ACE EXCEL C18-AR（2.1 mm×100 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.2%甲酸水溶液-乙腈（70∶30），流速0.3 mL·min-1，柱温30℃，进样量1 μL，0～5.0 min 进质谱检测。

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI 源），正离子模式检测，喷雾电压3.5 kV，离子传输管温度350℃，辅助气温度350 ℃，辅助气流量10 mL·min-1，鞘气流量40 mL·min-1，碰撞能量（NCE）50 eV，扫描范围为m/z50 ～235，扫描方式为SIM 扫描母离子，目标离子精确质量数：110.036 41，质谱图见图2。

图2 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇质谱图Fig 2 Mass spectrogram of S-1-amino-3-chloro-2-propanol

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液精密称取利奈唑胺原料50 mg，置50 mL 量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，滤过，取续滤液进样。

2.2.2 对照品溶液储备液精密称取S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐对照品约15 mg，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL 置200 mL 量瓶中，用水稀释制成每1 mL 中约含0.75 μg 对照品的溶液。

2.3 专属性

按照“2.1”项下条件进样，空白溶剂不干扰S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的测定，方法的专属性较好，色谱图见图3。

图3 空白溶剂质谱图Fig 3 Ion chromatograms of the blank solution

2.4 线性关系、检测限与定量限

精密量取“2.2.2”项下对照品溶液储备液适量，用水分别稀释制成3、12、15、18、22、30 ng·mL-1的S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐对照品溶液，进样测定，记录色谱图。以质量浓度（X，ng·mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得线性方程：Y＝1.601×105X+1.634×105（r＝0.9997）。

S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐在3.013 ～30.125 ng·mL-1与峰面积线性关系良好。将对照品溶液逐级稀释，在信噪比（S/N）约为10.0时测得定量限为7.53×10-5ng，在S/N约为3.0时测得检测限为7.53×10-6ng。

2.5 进样精密度与重复性试验

取“2.4”项下15 ng·mL-1的对照品溶液连续进样6 次，测得S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰面积的RSD为0.50%（n＝6），表明仪器精密度良好。

精密称取利奈唑胺原料（批号：27150501）约50 mg 共6 份，分别按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按”2.1”项下条件进行测定，记录色谱图。结果样品中均未检出S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐，表明方法重复性良好。

2.6 加样回收试验

分别精密称定已知含量（S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐未检出）的利奈唑胺原料（批号：27150501）9 份，再分别精密称取S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐对照品适量，用供试品溶液溶解，分别制成低、中、高浓度（80%、100%、120%水平）的溶液分别进样（各3 份），并作S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐随行标准曲线，按“2.1”项下条件进行测定，计算回收率，结果S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的低、中、高浓度的平均回收率分别为95.8%、94.1%、95.8%，RSD分别为1.8%、1.0%、1.5%。

2.7 稳定性试验

取利奈唑胺原料（批号：27150501）约50 mg置50 mL 量瓶中，用“2.4”项下15 ng·mL-1的对照品溶液稀释至刻度，于0、1、2、4、6、8 h进样测定并记录色谱图，以S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰面积为指标考察溶液稳定性。结果原料及制剂加标供试品溶液中S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰面积的RSD分别为1.9%，表明供试品溶液在8 h 内稳定性良好。

2.8 样品测定

按“2.2”项下方法制备对照品溶液及供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样测定，并作随行标准曲线，采用回归方程计算其含量，结果8批次原料均未检出S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐杂质（见图4）。

图4 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐离子色谱图Fig 4 Ion chromatogram of S-1-amino-3-chloro-2-propanol hydrochloride

3 讨论

3.1 流动相的选择

笔者曾用乙腈作为流动相，峰的响应较甲醇作为流动相时更高，分析原因为乙腈的离子化效果更好，样品更容易离子化。进一步比较了不同浓度如0.1%、0.15%、0.2%、0.25%甲酸水溶液作为流动相的峰响应情况，结果甲酸浓度越低，S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰响应越大，基线噪音越小，但综合考虑保留时间的影响，选择0.2%甲酸水溶液为流动相。

3.2 流动相比例的确定

分别比较了0.2%甲酸水溶液与乙腈在不同色谱条件下S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰与利奈唑胺峰的出峰情况，两者比例越接近（50∶50），S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰与利奈唑胺峰保留时间越近，考虑到利奈唑胺浓度过大，进入质谱检测器后过载，有可能造成检测器污染，因此，将比例设定0.2%甲酸水溶液-乙腈（70∶30），S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰杂质峰保留时间约为3.4 min，而主成分利奈唑胺峰约为9 min，质谱采集时间设定为0 ～5 min，利奈唑胺经液相洗脱后直接从废液管排出，以避免污染质谱。