G试验和GM试验联合无菌体液真菌培养检测对侵袭性念珠菌病的诊断效果评估

杨玉琪，雷玲玲，周磊，周柯，刘昊，郑恬，孔美娟，刘家云*（. 空军军医大学第一附属医院检验科，西安 7003；. 延安大学医学院，陕西 延安 76000）

侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的感染性疾病[1]。其中，侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis，IC）的病原菌是以念珠菌为主的酵母样真菌，可以占到所有IFD 的70%～90%。近年来，随着医疗技术的快速发展、器官移植的增多和抗菌药物的应用等，IC 的发病率逐渐上升[2]。IC 因其临床表现不特异而诊断困难，且治疗周期长，会导致病情凶险、死亡率高，从而对患者的生命和财产安全构成很大的威胁，因此早期诊断IC 对临床早期干预治疗具有重大意义[3]。

近几年，以1，3-β-D-葡聚糖（G 试验）和半乳甘露聚糖抗原（GM 试验）检测为主的血清学检测方法，因其具有非侵袭性、快速且阳性率高等特点，已被广泛应用于IC 感染的早期诊断[4-6]。前期调查研究显示，G 试验和GM 试验对IC 诊断的灵敏度和特异度各家报道差异较大[7-10]，分析发现其可能与各研究者所选择的研究对象数量、诊断IC 的诊断方式和判断标准不同有关。G试验和GM 试验诊断IC 相关研究的重点和难点在于IC 确诊标准的选择和确定，为进一步探讨G 试验和GM 试验在IC 早期诊断中的临床价值，本研究对本院2019年1月—2020年12月期间临床怀疑为IC 且无粒细胞缺乏的患者的G 试验、GM 试验和无菌体液真菌培养结果进行回顾性相关分析。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集本院2019年1月—2020年12月期间临床怀疑为IC 且无粒细胞缺乏，同时送检G 试验、GM 试验和无菌体液真菌培养的患者共计201 例。病例分别来自烧伤科、移植中心、血液科、麻醉监护室、心血管外科、心血管内科、神经内科、神经外科、肝胆外科、泌尿外科、呼吸内科、骨科、老年病科等。根据中国侵袭性真菌感染工作组2017年“血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第六次修订版）”确诊IFD的诊断标准，本研究根据无菌体液（包括血液、脑脊液及24 h 内的引流液）是否培养出酵母菌，并经临床确诊后分为：① 无菌体液真菌培养结果阳性，临床确诊为侵袭性真菌感染的49 例（IC 组），年龄在22 ～87 岁，平均年龄为（52.4±15.3）岁，男性32 例，女性17 例；② 无菌体液真菌培养结果阴性，临床确诊为非侵袭性真菌感染的152例（非IC 组），年龄在1 ～96 岁，平均年龄为（50.8±19.0）岁，男性104 例，女性48 例。

1.2 仪器与试药

1.2.1 仪器 微生物快速动态检测系统（IGL-800，北京金山川），全自动细菌培养系统（BACTEC FX，美国BD），全自动微生物鉴定及药敏分析系统（VITEK 2 Compact）、全自动快速微生物质谱检测系统（VITEK MS）（法国梅里埃），恒温恒湿箱（HWS-80B，天津泰斯特），Tol 智能恒温仪（D-91052，德国Erlangen），低温高速离心机（Micro 21R）、酶标仪（Multiskan FC）（美国Thermo）。

1.2.2 试药 GKT 动态真菌检测试剂盒和质控品（北京金山川，JBGSS8F205Q），GM 检测试剂盒（美国Bio-Rad，F92430），酵母菌鉴定卡（法国梅里埃，21343），血平板和沙保弱平板（郑州安图生物）。

1.3 方法

G 试验：严格按照仪器和试剂盒说明书进行标准操作，结果参考试剂盒说明书，G ≤60 pg·mL-1为阴性，G ＞60 pg·mL-1为阳性。GM 试验：严格按照试剂盒说明书进行标准操作，最后测定每个反应孔的OD值，通过换算，将待测样本的OD值转化为血清指数I（待测样本的血清指数＝待测样本OD值/标准对照血清OD值），结果参考试剂盒说明书，血清指数I ≤0.5 为阴性，血清指数I ＞0.5 为阳性。真菌培养及鉴定：无菌体液真菌培养及真菌病原学鉴定按《全国临床检验操作规程》（第四版）进行，报警阳性后，转种于血平板、沙保弱平板，采用VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统、全自动快速微生物质谱检测分析系统（MS）对真菌菌种进行鉴定。

1.4 统计学分析

应用统计学软件SPSS 23.0 进行数据处理及分析，以无菌体液真菌培养阳性为金标准，分析G 试验、GM 试验以及二者联合检测诊断IC 的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值、符合率等指标。数据经检验，计量资料是非正态分布，因此以M（P25，P75）对其进行描述；计数资料“例数（百分比）”以“n（%）”的形式进行统计学描述。两组间分类资料率的比较使用χ2检验，以P＜0.05 表明其差异有统计学意义。同时绘制ROC 曲线，对诊断效能进行分析。

2 结果

2.1 无菌体液标本来源

201 例可疑IC 且无粒细胞缺乏患者，其无菌体液培养标本主要来源于血液、脑脊液，以及无菌穿刺抽取的胸腹水、腹透液等无菌体液标本，具体见表1。

表1 无菌体液标本来源(n)Tab 1 Source of sterile body fluid samples (n)

2.2 菌株分布及报警时间

49 例无菌体液真菌培养阳性的IC 确诊病例，经鉴定菌株分布为：白色念珠菌17 株（34.69%），近平滑念珠菌14 株（28.57%），热带念珠菌8 株（16.33%），光滑念珠菌6 株（12.24%），新型隐球菌3 株（6.12%），解脂假丝酵母菌1 株（2.04%）。其中，阳性报警时间最短为13 小时5 分钟，最长为5 天16 小时，平均阳性报警时间为1 天23 小时24 分钟。

2.3 G 试验和GM 试验检测值水平

IC 组和非IC 组的G 试验和GM 试验其检测值水平及P值，见表2。

表2 IC 组和非IC 组G 试验和GM 试验检测值Tab 2 Detection value of G test and GM test in the IC group and the non-IC group

2.4 G 试验和GM 试验诊断IC 的临床效能

以G 试验和GM 试验检测结果大于阳性判断值为IC 实验室指标，以无菌体液培养真菌阳性结果为IC 确诊指标，计算G 试验、GM 试验以及联合检测诊断IC 的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等指标，见表3。

表3 G 试验、GM 试验诊断IC 的性能指数(%)Tab 3 Performance index of G test and GM test for IC (%)

2.5 分析不同浓度水平的G 试验和GM 试验对IC 诊断效能

将49 例IC 患者和152 例非IC 患者作为分组，绘制ROC 曲线并计算曲线下面积，见图1。其中，G 试验检测质量浓度在10.18 pg·mL-1时，灵敏度为87.0%，特异度为85.5%，诊断最高效能为AUC＝0.825（95%的置信区间72.9%～92%）；GM 试验血清指数为0.185 时，灵敏度为73.9%，特异度为40.1%，诊断最高效能为AUC＝0.559（95%的置信区间46.2%～65.6%）；G/GM 联合检测，诊断最高效能为AUC＝0.826（95%的置信区间：73.8%～91.5%）。

图1 G 试验和GM 试验诊断IC 的ROC 曲线Fig 1 ROC curve of G test and GM test for IC

3 讨论

根据中国侵袭性真菌感染工作组2017年“血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第六次修订版）”的标准，直接针吸或者活检取材的深部无菌部位标本，通过组织病理学或者细胞病理学检查是确诊IFD 的金标准，但是因其具有创伤性、耗时长，且其检出阳性率跟取材相关，易导致漏诊，因此对于诊断IFD 具有一定的局限性。而以无菌体液真菌培养阳性作为IFD 诊断的金标准，可以降低临床诊断的不确定性所造成的偏差，提高其客观性和准确性。本研究的阳性无菌体液标本，菌株分离结果最终均以念珠菌为主，故本文主要探讨G 试验和GM 试验对IC 早期诊断的效果和临床应用价值。

表2结果显示，IC 组和非IC 组G 试验的检测结果差异具有统计学意义（P＜0.001）；而两组GM 试验血清指数差异无统计学意义（P＝0.744）。提示G 试验的检测结果可以为IC 的早期诊断提供重要的参考，而GM 试验在两组间的差异无统计学意义，这与之前报道存在差异[11-12]。究其原因，1，3-β-D葡聚糖是除隐球菌和接合菌外所有真菌（包括念珠菌属、曲霉、镰孢菌属、酵母菌、毛孢子菌属、支顶孢属等）细胞壁的特有成分，而半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌特有的细胞壁多糖，本研究确诊的49 例IC 无菌体液培养真菌阳性菌株均为念珠菌属，对于念珠菌感染的患者，G 试验可呈阳性，而GM 试验为阴性，这可能是造成IC 组和非IC 组GM 试验检测结果无统计学差异的原因。表3结果显示，G 试验诊断IC 的特异度，不及GM 试验高；而G 试验诊断IC 的灵敏度明显高于GM 试验；G+GM 联合（两项试验均为阳性）特异度可以提高至98.03%，其均高于G 试验或GM试验单独检测的特异度；而两个试验进行G/GM 联合（两项试验中任何一项试验为阳性）灵敏度可以提高至82.61%，其也均高于G 试验或GM 试验单独检测的灵敏度。可以看出，G 试验和GM 试验联合检测可以提高对IC 的诊断效率，G 试验和GM试验结果同为阴性时可拟排除IC。且合理设置G试验和GM 试验的临床诊断界值可以提高诊断效能，G/GM 联合检测可以提高对IC 诊断的最高诊断效能，值得注意的是GM 试验单独用于无菌体液感染IC 的诊断其诊断效能较低。

G 试验和GM 试验具有检测速度快，操作简单，检测范围宽，连续定量检测可以为IFD 的治疗效果提供参考依据。文献报道，G 试验因受各种医疗操作（包括血透、输注免疫球蛋白、凝血因子等）、使用药物（包括抗肿瘤药物、磺胺类药物等）、食用蘑菇类食物、细菌感染的白血病等各种因素的影响造成试验结果出现假阳性[13-14]，而影响其出现假阴性的因素较少。GM 试验相对于G 试验，其影响因素较少，特异度可以达到85%以上[15]。本研究选用无菌体液真菌培养结果作为IFD 诊断的金标准，虽减少了因临床诊断IFD 导致的不确定性，但也导致针对检测侵袭性曲霉菌的GM 试验，其在IC 组和非IC 组差异无统计学意义，同时导致GM 试验的灵敏度较低，这是本研究不够全面的地方。

通过本研究综合分析，以无菌体液真菌培养结果作为IC 诊断的金标准，G 试验和GM 试验其特异度均在90%以上，G 试验的阴性预测值也达到90%以上，两者联合检测可以提高IC 的诊断价值，是无菌体液侵袭性真菌感染早期实验室诊断的重要检测指标；同时，两者同为阴性时对排除IC 具有明确的指导意义。合理检测G 试验和GM试验，综合分析两者的检测结果，可以为IC 的早期诊断、早期治疗提供有效的实验室支持。