流式细胞仪在环境微生物学实验教学中的应用与实践

翟利芳， 展思辉， 王 忠

（南开大学环境科学与工程学院，天津 300350）

0 引 言

流式细胞仪（Flow Cytometer，FCM）是以流式细胞术为理论基础，将激光技术、半导体技术、流体力学及光电测量技术等综合于一体的大型精密仪器［1-2］，其可对高速直线流动的细胞或者微生物颗粒进行快速测定与分析，具有检测速度快、数据采集量大，操作简单快捷等优点，已被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、微生物学等众多研究领域［3-7］。其中，在微生物学领域，流式细胞仪可以快速检测环境中各种细菌、病毒颗粒、特殊细菌、藻细胞及水中微生物活体、群落结构等，这些都是环境微生物学实验研究的对象［8-9］，因此将流式细胞仪应用到环境微生物学实验教学中对学生科研素质的培养及教学质量的提升至关重要。课题组将流式细胞技术引入环境微生物学实验教学过程对环境微生物进行测定，使学生利用现代仪器分析技术探究解决环境污染问题的有效途径，极大激发学生对环保综合探究性实验的兴趣。

1 流式细胞仪工作原理与特点

1.1 工作原理

流式细胞仪是用以测量在高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色或自带荧光特性的细胞或颗粒产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞或颗粒的物理、生理、免疫、分子生物学形状及功能状态进行定性或定量检测的一种现代分析仪器［10］。分析型流式细胞仪主要由液流系统、激光光源及光学系统、信号检测数据获取分析及电子系统共3 个部分组成。

将待测单细胞悬液经不同荧光物质染色，通过液压系统送入流动室，细胞在鞘液的包裹下形成单行排列的细胞流，以一定流速经过激光聚焦区。在激光束的照射下，细胞或颗粒产生特定的散射光和荧光信号，激发产生的信号通过波长选择性滤光片后，经荧光探测器接收并转化为电信号，最终通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号。计算机通过相应的软件对采集的数字信号进行分析处理，输出散点、密度或等高线图及数据表格等形式［11］。基本工作原理如图1 所示。

图1 基本工作原理

1.2 仪器特点

教学中心所配备流式细胞仪型号为Accuri C6 Plus，该仪器配有488 nm、640 nm 两个激光器；4 个光电倍增管（PMT）检测器，检测器呈X 环抱型设计；根据流动动力学聚焦原理实现5 ～40 μm 液流宽度可调，负压上样。该仪器日常使用的应用范围非常广泛，遍布免疫学和细胞生物学以及癌症研究、水生物研究、生物工艺等，具有以下功能和特点：

（1）创新的直观软件操作系统CFlow，可自动进行数据获取及圈门等数据分析。

（2）跨越7 个数量级的超宽动态范围，无需调节检测器电压。

（3）配备BD CSampler Plus 自动进样器提供可靠、易用自动化操作，支持48 孔板、96 孔板以及标准φ12 mm×75 mm管的24 管架。

1.3 上机培训

实验教学中将环境微生物学实验教学内容与流式细胞仪应用结合起来，从流式细胞仪对环境水样中死/活细菌进行鉴别并计数、微生物的分离与鉴定、微生物生长的测定、微生物生化特征测定等方面的应用进行讲解。主要包括4 个方面的内容：

（1）结合实际仪器构造讲解流式细胞仪的组成，由液流、光学及电学系统3 个部分组成。

（2）逐一开启稳压电源、仪器开关及计算机开关进入开机程序，强调开/关机之前、过程中及仪器日常维护的注意事项。

（3）运行CFlow软件，讲解软件界面组成、样品检测参数设置及常用术语、荧光补偿原理及调节、检测数据结果图示及表格分析。

（4）以细胞计数实验为例，藻/菌实验样品上机演示流式细胞仪在环境微生物检测中应用检测方法。

通过上机培训环节，学生在掌握流式细胞仪基本原理的基础上加深对仪器构造的认识，熟练掌握仪器使用方法，为后续实验操作环节奠定基础。

2 抗生素对铜绿微囊藻生长影响的测定

环境微生物学以微生物学的理论与技术为基础，研究有关环境现象、环境质量及环境问题，实验对象涉及环境中各种菌、藻等微生物，皆可应用流式细胞仪进行检测［12-13］。课题组设计了“抗生素对铜绿微囊藻生长的影响测定实验”，利用流式细胞仪测定某种抗生素进入水体对藻类生物量的变化影响。通过流式细胞仪和血球计数板对经过染毒处理的微藻进行计数，评价某种抗生素对藻类生长影响，同时验证流式细胞仪是否能够比血球计数板更加准确地对水体中微藻进行计数。

2.1 实验原理

近年来，因抗生素的滥用所造成的污染已经成为主要环境问题之一，引发的生态安全和健康问题引起人们的普遍关注。藻类是最简单的光合营养有机体，是水生生态系统的初级生产者。在一定环境条件下，如果某种有毒有害化学物质及其复合污染物进入水体，藻类的生命活动就会受到影响，生物量就会发生改变。通过测定藻类数量的变化，就可以评价抗生素对藻类生长的影响及对整个水生生态系统的综合环境效应。

铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa），属于蓝藻细菌，在环境中占据重要的生态位置，是水华爆发的主要藻类之一，故将其作为探究抗生素对环境中藻类影响的实验藻种。以培养一定时间的铜绿微囊藻为对照，在完全相同培养条件下，加入一定浓度的抗生素污染物后，定时、定点取样，直接测定水中藻浓度的变化。

2.2 实验仪器与试剂

实验仪器：电子天平、pH 计、光照培养箱、高速冷冻离心机、血球计数板、流式细胞仪、紫外可见分光光度计、灭菌锅、单人净化工作台、光学显微镜等。

实验试剂：四环素、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·H2O等配置培养基所需试剂等。

2.3 实验步骤

（1）培养液的配制。将储存母液混合、稀释，按照BG11培养基［14］进行配置，按一定体积分装在各个三角瓶中经121 ℃高压灭菌20 min。吸取一定体积母液加到灭菌后的培养液中，摇匀，使成所需浓度。

（2）藻种预培养。将所得铜绿微囊藻藻种移至盛有培养基的三角瓶中，在实验所设温度和光强下，通气或在三角瓶内保留足够空间培养，隔96 h 移种1 次，反复2 ～3 次，使藻种生长达到同步生长阶段，以此作为实验藻种。

（3）接种培养。将达到同步生长的藻种培养液充分摇匀，吸取一定体积加至各组培养液中。一般初始藻种浓度可采用（1 ～5）×106个/mL，接种量控制在10% ～20%。

（4）实验浓度的选择。根据四环素对铜绿微囊藻生长影响的半数有效浓度（EC50）范围［15-16］，设定对铜绿微囊藻96 h的EC50约为10 mg/L。设计藻液中抗生素浓度梯度为0、0.1、0.5、1、2、5、10、20 mg/L，各浓度组均设3 个平行样。

（5）培养条件。在（24 ±2）℃，白色荧光灯光照下培养，光强（2 000 ±200）lx。三角瓶可放置摇床上震荡（110 次/min）以便空气交换。光暗比为12 h ∶12 h。

（6）生长测定。在藻类毒性实验中，应定时取样测定藻类的生长情况，一般为24 h取样一次。在96 h取样测定污染物对藻类生长影响的EC50值，即与对照组相比，生长率下降50%的污染物浓度。

2.4 测试方法

本实验采用血球计数板和流式细胞仪两种测定方法对实验中铜绿微囊藻的数量进行计数，进而判断四环素对铜绿微囊藻生长的影响。

（1）血球计数板计数。取1 mL的微藻悬液于离心管中，加4%的戊二醛160 μL，静置5 min；试验采用25 ×16 格的血球计数板在显微镜下记录右上、右下、左下、左上、中间5 个中号方块中的微藻细胞数目。

（2）流式细胞仪计数。取0.5～1mL浓度在5×105～1×107个范围内的藻液，经300目筛网过滤置于流式上样管中；将上样管置于流式细胞仪进样针位置，设置参数：阈值设置80 000 on FSC-H，上样时间30 s，高速进样；检测。每一次进样速度重复3 次。

3 实验结果分析

3.1 两种测试方法结果对比

用血球计数板和流式细胞仪分别对同一浓度的微藻藻液进行计数，观察它们的平均值和相对标准偏差（见图2）。两种方法测定3 种不同浓度的微藻数量在平均值上相差不多，但从RSD（相对标准偏差）来看，血球计数板的RSD都在5%以上，样品2 的测定结果RSD值高达9.8%。由此，可以看出采用血球计数板的方法易受操作细节及操作者主观因素影响，精确性得不到保证，并且费时费力，不适用于大规模的细胞实验；而流式细胞仪对不同浓度的微藻藻液RSD 都在2%以内。由此可见，流式细胞仪比血球计数板的精确度高。

图2 两种测定方法精确度比较

3.2 四环素对微藻生长的影响

图3所示为采用流式细胞仪分析技术测定的四环素对铜绿微囊藻生长抑制情况。由图可见，随着染毒时间的增加，四环素对铜绿微囊藻的抑制作用相应增加，当四环素浓度较高时这种趋势更为明显。低浓度处理（0.1 ～2 mg/L）时，四环素类抗生素对铜绿微囊藻生长影响很小，而高浓度处理（5 ～20 mg/L）时，其对铜绿微囊藻产生明显的抑制作用。四环素浓度为20 mg/L，接触时间为96 h时，其对铜绿微囊藻的最大抑制率达到了68.35%。由此可见，四环素对铜绿微囊藻的毒性浓度效应非常明显。

图3 四环素对铜绿微囊藻生长抑制率的影响

4 结 语

流式细胞术作为一种新兴仪器分析技术，在水环境微生物测定方面还处于发展阶段，在环境微生物学实验教学中引入该检测技术是一次新的尝试。流式细胞术的引入丰富了环境微生物学实验教学内容及方法，拓展学生实验设计思维，不仅调动学生的学习热情，而且大大提高了大型贵重仪器的利用率。流式细胞术在环境微生物学实验教学中的应用，实现了科研与教学的有机融合，使学生的探索与实践能力得到显著提升，使学生在很好掌握流式细胞术的基础上可将其应用到今后的科学研究中。