皮质类固醇结合球蛋白的肝外表达研究进展

张雨欣，王畅

（烟台大学 药学院，山东烟台 264005）

皮质类固醇结合球蛋白（Corticosteroid-Binding Globulin，CBG），又称转皮质素（transcortin），1956年，DAUGHADAY通过平衡透析法首次发现；1961年，SEAL和DOE首次获得纯化CBG；20世界90年代起，在许多物种中对其进行克隆和表征[1]。CBG是一种与类固醇激素密切相关的单体糖蛋白，主要由肝脏合成，分泌入血调节皮质醇（CORT）的浓度，在皮质醇分泌高峰时起到缓冲作用，当局部出现炎症时，CBG作为皮质醇的储库又可快速释放大量皮质醇，发挥抗炎作用。已有证据表明，CBG广泛分布在不同组织中，肝脏不是CBG的唯一合成场所[2]。但其在组织中的功能是否同经典血液学功能一致，是否存在特异性的其他相关功能值得深入探究。本文简述了CBG的特点及其经典血液学功能，并总结了CBG在肝外组织中表达及功能的研究进展。

1 CBG简介

CBG由405个氨基酸残基组成，一级结构分子量约42 kDa，有6个N-糖基化位点，其中Asn347糖化为其发挥结合活性所必需[3]，非糖基化CBG结合皮质醇的能力比正常CBG低约60%[4]。CBG属于丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）超家族成员，与该家族中的抗胰蛋白酶（ATT）有40%以上的结构同源性[5]，具有serpin典型的三维结构特征：（1）包括三个β-折叠（A、B、C）、九个α-螺旋（hA～hI）、一个反应中心环（RCL），其中β-折叠B、α-螺旋hH和α-螺旋hA构成CBG的皮质醇结合口袋，RCL为中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的结合靶标；（2）在生理条件下CBG有R构象（Relaxed Conformation）与S构象（Stressed Conformation）两种状态，当NE插入到裸露RCL的Val344和Thr345之间，破坏皮质醇结合位点，S构象不可逆地转换成R构象，hD解螺旋，则大量皮质醇瞬时释放发挥局部抗炎作用。其中，S构象CBG与皮质醇的结合力高，又称为高亲和力CBG（ha CBG），R构象CBG又称低亲和力CBG（la CBG）[6-8]。

糖皮质激素（GCs）并不是CBG的唯一配体，性激素（SH）、盐皮质激素（MCs）等也可与CBG结合，且结合特征具有物种差异性[9]：人CBG与类固醇激素结合能力为皮质醇＞皮质酮＞17-羟基孕酮＞孕酮＞可的松＞醛固酮，几乎不结合雄激素[10]；而鸟类没有性激素结合球蛋白，CBG能以高亲和力结合雄激素[9,11]。

2 影响CBG变化的因素

在生理状态下，人血CBG的循环浓度在30～52 pg/mL，呈昼夜节律变化，18:00浓度最高，03:00左右浓度最低[12]。妊娠期受到雌激素的影响，随孕龄增加，CBG逐渐增加，妊娠末期可达正常的两倍。为了确保皮质醇运输至胎儿组织，其在合体滋养细胞膜的亲和力较正常状态CBG高约60倍，称作“妊娠特异性CBG”，能以高亲和力与孕酮结合，影响外周血和母-胎界面的孕酮水平[13-14]。在病理状态下，CBG的变化多伴随GCs异常。例如，多发性创伤患者的游离皮质醇减少、CBG增加；败血症、烧伤、感染性休克、糖尿病患者的游离皮质醇增加，CBG水平降低；在脓毒血症中，血浆中的CBG水平可迅速减少50%，从而增加游离的皮质醇水平，进而放大下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的激活效应。因此，一般认为CBG是一种负性调控的急性期反应物[10]。目前已发现4种遗传性CBG突变：CBG Leuven和CBG Lyon患者的皮质醇结合力降低70%～75%，CBG 0患者的CBG全缺失，CBG Santiago患者的晨时皮质醇及促肾上腺皮质激素（ACTH）刺激下的峰值皮质醇水平均降低。CBG功能缺陷的诊断和生理后果仍不明确，突变患者可能会表现出慢性疼痛、低血压、疲累、偏头痛、抑郁等肾上腺功能不全的症状，但并不完全相关[5,15]。

白介素-6（IL-6）是早期炎症反应的重要促炎细胞因子，能够在转录水平抑制CBG的合成[16]，且CBG基因启动子中存在IL-6的响应元件[17]。在HepG2细胞中观察到胰岛素及胰岛素样因子（IGF-1）能够抑制CBG的合成与分泌[18]。人体试验发现，胰岛素对CBG的抑制效应与糖耐受及体脂等个体因素有关：在超重和肥胖成人中，肥胖的耐葡萄糖受试者表现出强烈的血清CBG抑制效应；相反，在体脂率低的成人中胰岛素分泌越高，血清CBG浓度越低[19]。口服避孕药（如炔雌醇）能够增加CBG的合成，其与雌激素α受体有关[20]；肾上腺皮质类药物米托坦同样可以增加CBG的合成[21]。甲状腺激素能够提高基础代谢率，研究表明，内源和外源性甲状腺激素降低人血浆CBG水平，甲状腺激素对CBG生物合成的抑制作用可能有助于维持血浆葡萄糖水平，以满足由激素升高引起的代谢需求增加；但不同体外研究结果存在差异，可能与试验方法有关[22]。在生理范围内，皮质醇与CBG的结合对温度变化非常敏感，亲和力随温度升高而明显减小，HENLEY和LIGHTMAN发现，在35～42℃内，CBG会在发烧或外部热源刺激下释放皮质醇，但对生理范围内的pH变化不敏感[23]。

3 CBG的经典功能

经典的CBG功能为由肝脏合成并分泌入血，发挥皮质醇储库及运输的作用。血浆中白蛋白与CBG含量比约为775∶1，37 ℃下CBG与皮质醇的结合常数为3×107L/mol，而白蛋白主要结合人工合成的皮质激素、MCs等，与皮质醇亲和力低，结合常数为0.5×104L/mol[24-27]。生理状态下，血浆游离皮质醇含量小于血浆皮质醇总量的8%，有80%～90%的循环血皮质醇呈蛋白结合态[28-30]；当局部组织有炎症发生时，携带皮质醇的CBG在炎症部位聚集，在NE的作用下ha CBG转换为la CBG[31]，或者由胰凝乳蛋白酶将反应中心环上的两个亮氨酸残基裂解[32]，从而局部释放大量皮质醇，进入细胞发挥抗炎作用。

CBG经典功能如图1所示，黑色圆圈代表的生理过程分别为：（1）游离皮质醇扩散到细胞中，调节细胞内生理活动；（2）循环中，15%的皮质醇以低亲和力与多含量白蛋白结合；（3）高亲和力CBG构成皮质醇储库，有针对性地将皮质醇输送到炎症部位；蛋白水解酶（如中性粒细胞分泌的中性粒细胞弹性酶）裂解CBG，降低皮质醇结合的亲和力并释放出皮质醇；（4）CBG对温度变化敏感，结合亲和力降低，少量释放皮质醇；（5）低亲和力CBG仍能部分结合皮质醇，作为重要的动态缓冲器；（6）皮质醇结合的CBG可能与特定的受体结合；（7）CBG mRNA在细胞内定位，可能调节皮质醇进出特定细胞。

图1 CBG经典功能

目前，人们对血CBG的作用阐释可分为总激素、游离激素和结合激素三种经典假说[33]，MALISCH和SATTERLEE[34]提出的储库假说可视为对游离激素假说的进一步阐述。（1）总激素假说：该假说认为血浆中的所有激素（结合态和游离态）均可自由进入组织，结合相应受体发挥效应，即100%的血浆类固醇具有生物活性，水溶性的CBG结合脂溶性激素主要发挥载体功能[35]。（2）游离激素假说：生理条件下，CBG大小通常为50～60 kDa，同CBG结合的激素均无法自由进入组织液，只有游离态激素能够发挥生物活性[10]。储库假说认为，不仅游离激素具有生物学活性，类固醇激素-CBG复合物同样具有其他生物学活性，血浆中与激素结合的CBG可作为储库，当CBG的含量或结合亲和力下降时，释放结合激素发挥生物活性，CBG的节律变化即为储库假说的有力证据[36]。（3）结合激素假说：该假说同样认为类固醇激素-CBG复合物有生物学活性，并猜想细胞膜上存在相应的CORT-CBG结合受体，CORT-CBG复合物与受体结合发挥直接或间接效应。此猜想主要建立在对脑内CBG研究的基础上，但未有实验性证据，作者认为若能够在脉管系统中发现相关的膜转运蛋白，且影响细胞外CBG结合激素的功能时，结合激素假说或许将有实质性突破[37]。

4 CBG在肝外组织中的分布

4.1 CBG在脑内的表达

1984年，在人脑脊液（CSF）中发现有浓度低于血浆的CBG存在[38-39]，但不能确定其来源；2006年，MOPERT等[40]第一次在大鼠下丘脑中检测出CBG；随后，人们发现CBG在不同脑区、不同神经细胞群（神经元和神经胶质细胞）中广泛分布，在大鼠和小鼠脑中的伏隔核、丘脑、中隔、海马、苍白球、杏仁核、布罗卡斯区及大脑皮层等区域均有CBG的表达[41-43]；此外，发现下丘脑含有编码CBG的mRNA，且全序列测定结果显示，CBG的下丘脑cDNA与肝脏完全一致[41]，由于大小限制CBG不能通过血脑屏障。以上这些研究共同说明脑组织能够自身生成CBG。

中枢CBG广泛分布很可能具有某些特殊功能，并且与GCs密切相关。下丘脑中的CBG与神经脑垂体激素-加压素和催产素共定位，用秋水仙碱预处理后CBG的免疫反应性增加，说明CBG可随两种激素一同沿细胞轴突在轴浆中向末梢流动，释放到体循环中，即CBG很可能参与了HPA轴中的某一环节[44]。特异性敲除CBG基因的小鼠在应激期间能够观察到绝望行为和记忆变化，表现出更多的抑郁样行为学特征，这种特异性的神经变化表明CBG可能不仅局限于参与炎症反应，在情绪调控中也有重要作用。荧光分析发现脑内CBG与糖皮质激素受体不处同一位置，可能某些神经元中产生的CBG能将糖皮质激素输送到无糖皮质激素受体的细胞中，即CBG可能参与了中枢类固醇激素的非基因组作用机制[45]。

4.2 CBG在心脏的表达

RT-PCR表明，人心肌细胞能够自主合成CBG，且扩增大小同肝脏CBG相同；荧光染色结果显示，CBG在近乎所有心肌细胞质中有免疫反应性，其在浦肯野纤维中的免疫原性最强，在细胞膜、血管内皮细胞、心肌动脉壁上的平滑肌细胞及心内膜细胞核中也有较强的荧光反应；荧光共定位实验显示，CBG与盐皮质激素受体（MR）共定位[46]。

CBG能够与GCs、MCs结合，因此心肌CBG可能发挥同血浆CBG类似的缓冲作用，能够调控激素释放，平衡GCs和MCs水平，起到心肌保护作用。心肌细胞中糖皮质激素受体（GR）含量低，GCs主要同核MR结合发挥慢效应[47-48]；CBG与MR共定位，可能作为激素与受体结合前的中间介质，起到传递类固醇激素的连接作用。浦肯野纤维是一种特化的心肌细胞，能够快速有效地传导心脏动作电位，协调心脏收缩，且与心律失常、心源性猝死等疾病的发生密切相关。已有研究证明，长期应激与心律失常的发生有关，CBG在该处的强免疫原性提示其可能参与了心脏传导系统功能[49]。类固醇激素及其受体与心血管系统的作用复杂，近年来的研究认为，GCs存在另外的独立于核受体的快速非基因组效应，但具体机制未明；心肌细胞膜上检测到有CBG的免疫原性，因此猜测存在CBG的膜受体，可与配体GC-CBG复合物结合，发挥快速非基因组效应[23,50]。

4.3 CBG在睾丸的表达

1987年，HAMMOND等[37]通过Northern blotting方法发现睾丸组织中有低水平的CBG表达；SUN等通过RNA荧光原位杂交（FISH）首次证实了CBG在睾丸间质细胞中特异性表达；过表达CBG后，与类固醇合成相关的四种蛋白（StAR，CYP11A1，CYP17A1和3β-HSD）上调；敲低CBG后细胞孕激素水平显著下降，与类固醇激素合成相关的蛋白质水平也相应降低；黄体生成素（LH）通过G蛋白偶联受体介导的信号通路调控性激素的合成，研究显示LH能够刺激细胞产生及分泌CBG，提示CBG在睾丸间质细胞中的表达可能与性激素的合成有关；蛋白印迹结果显示，在小鼠睾丸中观察到CBG的两种电泳亚型，表明CBG具有糖基化异质性[51]。糖代谢组学研究认为，CBG在不同生理状态下N-糖基化的程度不同，不同的糖基化方式可能影响CBG的折叠、分泌、半衰期及对类固醇激素的靶向作用，并影响其生物学功能[52]。这些研究为CBG发挥细胞组织内的激素转运体作用假说提供了依据，睾丸间质细胞CBG的特异性表达在睾酮合成、分泌等过程中的作用值得进一步探索。

4.4 CBG在白色脂肪组织的表达

白色脂肪组织（WAT）是储存能量的主要部位，也是GCs的主要靶组织。del MAR GRASA等[53]在WAT质膜细胞周围的薄层中发现有CBG表达，卵巢周围的WAT中有CBG的mRNA，证明WAT能够产生CBG，但合成能力远小于肝脏。GULFO等[54]发现，在脂质过量的情况下，CBG缺乏会促使脂质从皮下脂肪分配到内脏脂肪库，并影响Ⅱ型11β-羟基类固醇脱氢酶（一种控制糖皮质激素发挥活性的酶）的表达。

针对CBG包被分布在WAT细胞周围发挥何种功能，有如下猜想[53]。（1）可能作为一种保护性屏障，通过结合亲和力与含量的变化调节这种“门控”作用，抑制GCs与脂肪细胞的识别结合，限制GCs进入脂肪细胞。（2）游离脂肪酸与CBG结合可能调控了CBG与皮质酮的结合能力。脂肪细胞内GCs与受体结合会引起脂解反应，释放非酯化脂肪酸进入间隙后入血，较高浓度的不饱和脂肪酸增强皮质酮与CBG的结合力，但饱和脂酸降低二者结合力。（3）“CBG层”可能构成调节GCs作用于白色脂肪细胞的反馈环，并且通过改变CBG的合成及内化速率来加强这种反馈调节。这些猜想认为WAT周围的CBG环是一种保护系统，在脂肪分解加强的情况下降低WAT对GCs的敏感性，以减少不必要的脂肪储备[55]。

肥胖者的应激反应往往更强，且HPA轴的功能通常发生改变，其中GCs是肥胖发生和维持的重要因素。OUSOVA等[56]提出，CBG基因是皮质醇水平和肥胖易感性的关键调节因子，人血浆CBG水平被视为胰岛素分泌的标志物，胰岛素能够抑制CBG的表达，且CBG与胰岛素抵抗密切相关[18,57-58]。因此，CBG很可能在GCs驱动下的代谢紊乱中有重要作用[59]。

5 CBG在肝外组织表达的功能

除了上述提到的组织外，CBG在肺、子宫内膜、胎盘、肾上腺、肾脏等组织器官中也表达[60-64]。CBG在不同组织中的表达可能发挥某些同类功能。（1）膜受体：使用高纯度的125I-CBG作为探针，发现CBG与由人前列腺组织制备的膜有特异性结合，且这种结合是时间和温度依赖性的（与37 ℃相比，在4 ℃和23 ℃时的结合可以忽略不计），Ca2+与Mg2+是结合的必要条件，其他血浆蛋白不结合该膜受体[37]。在其他组织膜上也得到了类似的结果，如孕酮-CBG复合物能够特异性结合人的子宫内膜[65]；在人肝细胞的质膜中发现了识别和特异性结合天然CBG-皮质醇复合物的结合位点[66-67]；胎盘细胞质膜上也有CBG的特异性结合位点，且膜结合受糖蛋白分子构象及其碳水化合物链结构的影响[68]；在心肌细胞膜上有明显的CBG免疫反应性[46]。这种特异性的CBG膜受体可能有着激活第二信使、内化CBG-类固醇激素复合物、释放用于局部递送的类固醇、介导GCs的快速非基因组效应等作用[69]。（2）生物标志物：血液CBG作为急性期蛋白，其变化（特别是CBG的蛋白水解）可作为炎症早期症状发生前和炎症发作严重程度的重要生物标志物[70]。此外，心肌CBG在预测心血管风险、脑脊液CBG在预测压力相关抑郁症风险、遗传变异CBG在识别慢性疲劳综合症风险以及监测潜在有类固醇过量风险等诊断中可能具有重要价值[49]。（3）性别二态性：在肾上腺、肺等中发现与肝脏相反的CBG二态性[62,65]，在糖耐受实验中发现CBG的表达具有性别二态性，女性表现出较低的CBG水平，且与高脂肪含量呈更强的相关性[71-72]。

6 结语

CBG在多种组织中有表达，除了经典的血浆作用外，已有大量有关其组织特异性效应的报道，但是有关CBG在组织中广泛分布的真正生理意义的报道很少。本文总结了CBG的相关背景及其肝外组织表达研究进展，CBG在局部炎症应激反应、GCs水平调控、孕酮转运、能量代谢等过程中很可能充当重要角色，针对CBG如何选择性结合GCs和MCs、CBG是否参与到GCs的非基因组途径、CBG的膜受体存在的共有或特异功能等问题仍有很大挖掘潜力。因此，可从多角度着手，以GCs在某个组织的作用为出发点，结合不同组织的特异性功能及病理生理学特征，进一步探索CBG的功能。