松果菊F3'H基因的克隆及表达分析

吴红松，秋田祐介

（1.日本埼玉工业大学 生命环境化学系，日本深谷 369-0293；2.菏泽学院 生物科学系，山东菏泽 274000）

松果菊是世界上最著名的药用植物之一，近年来因其观赏特性而备受关注。目前，针对松果菊的分子研究集中于遗传多样性，与花青素生物合成相关的基因研究鲜有报道。

类黄酮3'-羟化酶（Flavonoid 3'-Hydroxylase，F3'H），是花青素合成的关键基因，最初由BRUGLIERA等[1]从矮牵牛（Petunia hybrida）中分离并鉴定，目前已报道多种植物含有此基因。研究表明，F3'H负责B环3’位置的羟基化位置和程度，从而形成不同的花青素。因此，鉴定功能基因F3'H是了解松果菊中花青素羟基化和花色形成的重要步骤。研究发现松果菊F3'H（EpF3'H）的表达特点与菊花F3'H（CgF3'H）在菊花所有器官中的表达和百合F3'H（LvF3'H）在百合有色花瓣和无色花瓣中的表达结果相似[3-4]。EpF3'H的表达水平与花发育过程中花青素的形成和积累趋势基本一致，可能具有协同促进松果菊花瓣中花青素合成和积累的作用。但黄文坤等[5]发现F3'H在紫茎泽兰类花瓣中的表达低于在叶中的表达，可见F3'H基因在不同品种、组织和生长阶段具有不同的时空表达模式，它们的组织特异性表达可能受调控基因的影响

本文利用3'-RACE和5'-RACE法克隆了EpF3'H的cDNA，并分析了该基因在不同组织中的表达，以便开展针对松果菊花色的分子育种计划。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

松果菊购自Sakata Seed Co.（日本），室外栽培。采摘时将松果菊开花阶段分为四个时期，分别命名为S1、S2、S3和S4：S1——花瓣闭合，绿色（长度小于15 mm）；S2——花瓣开始着色（长约20 mm）；S3——花瓣绯红，刚刚绽开（长约20 mm）；S4——花瓣平展，花色紫红（长约30 mm）[2]。从不同开花阶段中收集花瓣和叶，实验至少重复三次。收集后立刻液氮预冷，在RNA提取前储存于-80 ℃。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），日本Sigma；M-MLV逆转录酶，日本Takara；DNase I，日本Takara；3'-RACE和5'-RACE试剂盒，德国Roche。

T100型PCR仪，美国BIO；ABI 3730xl Analyzer型自动测序仪，美国Applied Biosystems；QuantStudio™1型RT-PCR仪，美国Thermo Fisher Scientific。

1.2 EpF3'H全长cDNA的克隆

从不同开花阶段（S1～S4）的花、叶中用CTAB法提取总RNA。2 μg RNA为模板，Oligo（dT） 21为引物，用M-MLV逆转录酶转录，DNase I处理，总体积20 μL，合成得EpF3'H的cDNA。使用3'-RACE和5'-RACE法扩增F3'H基因的全长cDNA片段。

设计一对引物EpF3'H-FP：5'-ATGACTATT CTAACCCTACTATCATACACC-3'，EpF3'H-RP：5'-TTAACCACTTTCATATACTTGAGG-3'。PCR 参 数为：95 ℃预变性5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min，分离、连接、转化、测序，获得全长cDNA片段。

1.3 系统发育分析

使用Genetyx-ver 12软件对不同植物F3’H蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，Clustalw多重比对的相邻连接法构建系统进化树，bootstrap检验的重复次数为1 000次。

1.4 生物信息学分析

测序得到的EpF3'H基因的序列信息提交到NCBI，通过BLAST与核酸和蛋白质数据库进行比对搜索，利用NCBI查找开放阅读框（ORF），预测EpF3'H基因编码蛋白的理化性质。

1.5 表达分析

采用SYBR green荧光染料进行RT-PCR，每个PCR反应总体积20 μL，引物EpF3'H-FP1：5'-ACAGTGGAATGGGCAATAGC-3'，EpF3'H-RP：5'-TTAACCACTTTCATATACTTGAGG-3'。采用 2-∆∆Cq计算各基因的相对表达量，以EpACT1作为内参基因，实验重复4次。

2 结果与分析

2.1 EpF3'H基因全长cDNA序列的合成

通过3'-RACE和5'-RACE扩增出cDNA的3'和5'端，从而获得EpF3'H的全长cDNA序列。ORF为1 533 bp，编码510个氨基酸（GenBank登录号OL828207），蛋白分子量为56.49 kD，pI为8.46。通过与NCBI上已登录的菊花、郁金香、葡萄等的F3'H蛋白序列进行比对，发现克隆的基因为F3'H基因。

2.2 EpF3'H的同源性和结构特征

从NCBI Blast的比对结果中选取来源于其他24种植物的F3'H蛋白与松果菊EpF3'H蛋白，用相邻连接法构建系统进化树（见图1）。从图1中可以看出，不同物种来源的F3'H蛋白在进化上归属不同的分支，EpF3'H与非洲菊杂交种、菊花的F3'H亲缘关系较近，处于同一分支上。蛋白质多序列比对分析显示，EpF3'H与非洲菊杂交种（DQ218417）、菊花(AB523844)高度同源，相似度分别为83.52%和82.67%，这表明EpF3'H是F3'H家族成员。F3'H可通过底物竞争羟基化二氢黄酮醇3'位，合成紫红色色素的前体物质，EpF3'H可能与其他F3'H蛋白一样具有相同的催化功能。

图1 EpF3'H与其他植物F3'H蛋白的系统进化树分析

通过NCBI保守基序的比对发现，EpF3'H蛋白功能结构域（细胞色素P450结构域）有四个特有保守基序和三个F3'H特有保守基序，表明EpF3'H是典型的F3'H蛋白。

2.3 EpF3'H的基因表达

RT-PCR结果（图2）显示，EpF3'H在松果菊的叶和花中均有不同程度的表达。EpF3'H在S4花期中表达量最高，其他时期表达量从高到低依次为S2、S1、S3和叶。可见，EpF3'H的表达模式大致与花青素积累模式相对应。

图2 EpF3'H基因相对表达量

3 结论

研究表明，EpF3'H参与了松果菊花色形成，也发挥了类似于F3'H在拟南芥等物种中的功能[6]，可决定无色二氢黄酮醇的羟化位置和程度，从而合成不同种类花青素苷。