高效液相色谱法同时测定化妆品中4种表外防腐剂

李彦君，漆爱明，肖树雄，曾子君

（广东省药品检验所 国家药品监督管理局化妆品风险评估重点实验室，广东广州 510300）

2019年11月起，欧盟委员会允许增加具有防腐和调理皮肤功能的羟基乙氧基苯基丁酮作为化妆品防腐剂。对羟基苯乙酮是一种天然植物提取物，具有防腐增效的作用，在较宽的pH和温度范围内都有优异的稳定性。对茴香酸是一种天然存在于茴香中的有机酸，在酸性条件下可防止真菌霉素的合成，具有抗菌的功效。辛酰羟肟酸是一种有机酸，是选择性强的金属离子螯合剂，因其优异的抑菌性能被广泛应用于化妆品中，在国外也有广泛应用。

对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸均在《已使用化妆品原料名称目录（2021年版）》[1]中，由于都具有抑菌的功效，同时不属于《化妆品安全技术规范》中准用的51类防腐剂[2]，常被商家添加到化妆品中并宣称为“无防腐剂”化妆品，也称之为防腐替代方案[3]。防腐替代方案普遍使用时间不长，缺乏安全评估数据，有必要对其添加量进行监管。目前，羟基乙氧基苯基丁酮尚未有国家标准检测方法，其余3种物质都只有单组分检测方法，无法应用于多组分的同时测定[4-11]。因此本文通过建立相应的检测方法，以期为监管表外防腐剂的添加情况提供技术支撑，同时为监管部门日后制定相关限值要求提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

对羟基苯乙酮，纯度98.25%，上海麦克林生化科技有限公司；羟基乙氧基苯基丁酮，纯度97%，加拿大TRC公司；对茴香酸，纯度99%，上海麦克林生化科技有限公司；辛酰羟肟酸，纯度99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇，色谱纯，德国默克公司；磷酸，分析纯，广州化学试剂厂。

岛津LC-20A液相色谱仪，日本SHIMADZU公司；Milli Q Reference超纯水发生器，MILLIPORE公司；XS205DU十万分之一电子天平，瑞士METTLER公司；CPA224S万分之一电子天平，德国SARTORIUS公司；ElmaDE-78224超声波清洗器，广州市东南科创科技有限公司。

样品来源：市面上购买，有针对性选取14批标签标识有文中4种表外防腐剂的样品及5批未标识有文中4种表外防腐剂的样品。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测器PDA，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液（体积比20∶20∶60），等度洗脱，流速1 mL/min，扫描波长190～400 nm，检测波长275 nm和210 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL。

1.2.2 标准溶液的配制

分别精密称取50 mg标准物质于不同25 mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，摇匀，得单标储备液。精密吸取对羟基苯乙酮和对茴香酸各0.4 mL、羟基乙氧基苯基丁酮和辛酰羟肟酸各2 mL于20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得标准混合溶液。分别精密吸取标准混合溶液0.125 mL、0.625 mL、1.250 mL、2.500 mL、5.000 mL和10.000 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得系列标准溶液。上机前均经0.45 μm滤膜过滤。

1.2.3 样品处理

称取样品1.0 g（精确至0.000 1 g）于10 mL具塞比色管中（必要时，置于水浴中去除乙醇等挥发性有机溶剂），加甲醇定容至刻度，涡旋混匀，300 W超声提取20 min。经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

本研究分别考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液（体积比45∶55）、乙腈-0.1%磷酸水溶液（体积比35∶65）、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（体积比20∶20∶60）对4种表外防腐剂出峰情况的影响。由于部分化妆品存在同时添加表外防腐剂和表内防腐剂的情况，因此建立的方法应有效分离对茴香酸与常用防腐剂羟苯甲酯。结果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液条件下，对茴香酸与羟苯甲酯出峰时间接近，光谱图相似，存在干扰。而乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相时，各组分分离度和洗脱用时均优于甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相。因此，选择乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相，各组分分离情况如图1所示。。

图1 标准溶液色谱图

2.2 检测波长的选择

在190～400 nm波长范围内进行光谱扫描。结果显示，对羟基苯乙酮、对茴香酸和羟基乙氧基苯基丁酮的最大吸收波长分别为275 nm、254 nm和281 nm，在满足灵敏度的前提下，为便于检测，选择275 nm为该3种组分的检测波长。根据参考文献[11]选择210 nm作为辛酰羟肟酸的检测波长。

2.3 样品前处理条件的选择

研究甲醇和乙腈分别作为4种表外防腐剂提取溶剂时，在相同的色谱条件下，对目标物质的响应差异。结果表明，用甲醇作为提取溶剂时，各目标物质的响应均明显优于乙腈，且甲醇毒性低于乙腈。因此，选择甲醇作为对照品提取溶剂。为减少溶剂效应，选取甲醇作为样品的提取溶剂。

以甲醇为提取溶剂，考察不同基质化妆品在不同超声时间下的回收率。在300 W超声功率下，选取了10 min、20 min和30 min 3个时间点研究超声时间与提取率关系。结果显示，各基质化妆品超声提取20 min以上提取率没有明显变化。因此选择以甲醇作为提取溶剂，超声20 min作为样品前处理条件。

2.4 线性关系

以各组分标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，实验结果见表1。结果显示，对羟基苯乙酮、对茴香酸、羟基乙氧基苯基丁酮和辛酰羟肟酸在一定浓度范围内呈现良好的线性关系。相关系数均大于0.999 5。按S/N=3计算得出检出限分别为 0.5 μg/g、1.0 μg/g、2.4 μg/g和7.5 μg/g（该浓度表示化妆品中的含量）。

2.5 回收率

取液体、乳液和膏霜3种不同基质的空白样品，分别添加3个浓度水平的标准溶液进行加标回收实验，每一水平设6个平行，按1.2.3样品前处理方法制备待测样品，标准曲线法定量，计算回收率和精密度。由表2～5可知，该方法的回收率为92.3%～103.3%，相对标准偏差RSD≤1.7%。结果表明该方法具有良好的准确度。

表3 对茴香酸平均回收率和RSD

表4 羟基乙氧基苯基丁酮平均回收率和RSD

表5 辛酰羟肟酸平均回收率和RSD

2.6 精密度

考察了低、中、高3个质量浓度标准溶液的精密度，日内分析6次，连续测定3 d。由表6可知，各组分日内精密度RSD为0.1%～1.0%；日间精密度RSD为0.3%～1.2%。实验证明，该方法精密度高。

表6 日内精密度和日间精密度（n=6）

2.7 重复性试验

平行配制6份供试品溶液，在相同条件下上机测量，以6次测定值来考察方法重复性，计算得对羟基苯乙酮、对茴香酸、羟基乙氧基苯基丁酮和辛酰羟肟酸RSD分别为0.2%、0.2%、0.6%和1.2%（n=6），表明该方法重复性好。

2.8 实际样品测定

应用所建立的方法，对19批次3种不同剂型的化妆品进行测定，并与标签进行对比，结果见表7。

表7 样品标签标识情况和检出情况

对19批样品检测结果进行分析。（1）共有3批检出标签未标示组分对羟基苯乙酮，说明加入这些物质而未标识十分普遍。（2）羟基乙氧基苯基丁酮虽已列入欧盟准用名单，但目前国内还未列入已使用目录，产品中没发现添加，是否纳入国内准用表有待研究后确定。（3）样品中对羟基苯乙酮的含量在0.16%～0.69%、对茴香酸的含量在0.065%～0.090%、辛酰羟肟酸的含量在0.010%～0.048%，目前对这几个物质还没设定限值，建议通过安全评估后设定合理限值。

3 结论

本文建立了高效液相色谱法测定化妆品中4种表外防腐剂的含量测定方法。以甲醇作为提取溶剂，300 W超声提取20 min，采用C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行分离。经过方法学考查，线性、回收率、精密度和重复性结果均在规定范围内，具有良好的适用性，为化妆品中4种表外防腐剂的含量测定提供了参考依据，能够进一步规范化妆品中防腐剂的使用。