DPPH体系优化及无花果黄酮清除自由基性能研究

杨程宇，梁熳珊，黄春怡，黎金英，金元宝

（珠海科技学院 药学与食品科学学院，广东珠海 519041）

无花果（Ficus caricaLinn.）为桑科落叶小乔木，分布广泛。现代研究表明，无花果能够有效清除自由基、保护机体生物大分子，具有抗肿瘤、抗动脉硬化以及调节免疫等药理作用。无花果中的黄酮类化合物具有很好的化学活性，可以抗氧化、抗衰老和预防心血管疾病，且不同品种清除自由基的能力有所不同。

目前抗氧化的评价方法较多，例如DPPH法、ORAC法、ABTS法以及羟自由基法等体外研究方法[1]。其中，DPPH法在化学、中药学、食品科学等领域的抗氧化作用的研究上应用广泛，大部分学者都采用DPPH法对黄酮的抗氧化性能进行研究[2]。虽然DPPH法已经相当成熟，但是现实情况下，不同操作人所面临的实验室温度、实验时间长短、是否避光等实际操作条件皆有不同，因此测量后得到的结果也有很大差异，导致DPPH法的重复性差[3-4]。

郭英等[5]对无花果品种进行了系统研究，将其分为波姬红、布兰瑞克、中国无花果等品种。本实验以无花果中的青皮、波姬红、布兰瑞克品种为样品，对其黄酮提取物进行DPPH清除活性研究，并对其是否避光、实验温度、实验时间的反应条件进行了优化，对DPPH清除活性的评价具有重要意义[6]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

青皮无花果，山东威海耐心果园；波姬红无花果，广东东莞忆品香水果店；布兰瑞克无花果，山东临沂绿佳合作社。

DPPH，色谱级，飞净科研试剂公司；无水乙醇，分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司；芦丁，色谱级，中国食品药品监督管理局；石油醚，分析纯，沸点30～60 ℃，天天津市欣宽福利化工厂；硝酸铝，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；亚硝酸钠，分析纯，天津市登科化学试剂有限公司；氢氧化钠，分析纯，天津市迪恩化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

UV-2800型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；XH-300A微波超声波组合萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司；FA2004N电子分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；EYE-LA型旋转蒸发仪，日本东京理化株式会社；L-01冷冻干燥机，上海东方龙科技有限公司。

1.2 样品制备

1.2.1 无花果中提取总黄酮的样品制备

无花果（青皮、波姬红、布兰瑞克）用75%的乙醇擦洗并切片，然后冷冻干燥、粉碎和过40目筛，接着使用石油醚通过索氏提取法脱脂，最后干燥并储存在干燥柜中，备用。准确称取（1.00±0.02）g无花果样品，按实验设计加入对应浓度的乙醇，搅拌均匀，在黑暗中静置60 min，通过超声-微波法提取无花果中的黄酮化合物，具体工艺条件见表1。

表1 无花果黄酮提取工艺

将无花果总黄酮提取物冻干成粉末状，精密称取（0.175±0.002）g冻干粉末，使用40%乙醇溶液定容至25.0 mL容量瓶，摇匀后得样品溶液。

1.2.2 0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液的制备

在电子分析天平上精确称取0.003 9 gDPPH粉末，并用无水乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶，配置成0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3 黄酮提取率测定

精密称取50.0 mg芦丁标准品，40%乙醇定容到50.0 mL，得到对照品母液，无花果中黄酮的检测采用硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠显色法，在紫外分光光度计的510 nm波长下测量吸光度，以40%的乙醇溶液作参比[7-8]。通过线性回归处理得到标准曲线如图1所示，线性方程为y=4.457 2x+0.410 2，R2为0.999 9。无花果中黄酮提取率的计算公式如下：

图1 芦丁标准曲线

1.4 无花果提取物清除DPPH反应体系的优化

1.4.1 反应时间

取0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液4.0 mL，加入按照表1条件提取的青皮无花果黄酮提取物溶液1.0 mL，在25 ℃条件下避光，测试其在510 nm的吸光度，每隔5 min测定1次，连续12次，平行实验3次，计算平均值和RSD，依据以下公式计算DPPH清除能力[9-10]：

式中：Ai为无花果总黄酮提取物+0.1 mmol/L DPPH溶液反应后的吸光度；Aj为无花果总黄酮提取物+无水乙醇溶液反应后的吸光度；A0为无水乙醇溶液+0.1 mmol/L DPPH溶液反应后的吸光度。

1.4.2 光照条件

取0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液4.0 mL，加入按照表1条件提取的青皮无花果黄酮溶液1.0 mL，室温条件25 ℃，分别在避光和实验室的自然光条件下反应，反应30 min后，以无水乙醇为空白对照，测定510 nm处的吸光度，平行实验3次，计算平均值和RSD，依据公式（2）计算DPPH清除能力。

1.4.3 反应温度

取0.1 mmol/L的DPPH-CH2CH3OH溶液4.0 mL，加入按照表1条件提取的青皮无花果黄酮提取物溶液1.0 mL，避光，分别于4 ℃和25 ℃反应条件下放置30 min，测定510 nm处的吸光度，平行实验3次，计算平均值和RSD，依据公式（2）计算DPPH清除能力。

1.5 无花果提取物清除DPPH性能研究

加入按照表1条件提取的无花果黄酮提取物冻干粉，用无水乙醇溶解，稀释得到浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的样品液。接着，加入4.0 mL的0.1 mmol/L DPPH-CH2CH3OH反应，置于25 ℃暗处反应30 min。最后，使用紫外分光光度计测定其在510 nm处的吸光值，用无水乙醇作参比，重复3次，计算平均值、RSD值，DPPH清除率按公式（2）计算。

1.6 数据分析

通过软件IBM SPSS Statistics 26进行数据分析，计算提取率；采用Origin 2019绘图。

2 结果与分析

2.1 无花果总黄酮含量

3个品种的无花果分别使用表1的条件提取黄酮，使用硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠显色法，在紫外分光光度计的510 nm波长下测量吸光度，结果表明波姬红品种无花果可以提取到的黄酮含量最大，提取率最高，其次是青皮品种和布兰瑞克品种。

表2 无花果中黄酮含量

2.2 无花果提取物清除DPPH反应体系优化

2.2.1 反应时间

如图2所示，前30 min内，清除自由基能力上升较快，30～60 min清除能力上升速率较为缓慢，清除能力的差异并不明显，因此考虑到时间成本的问题，反应时间30 min为最佳选择。

图2 反应时间对无花果提取物DPPH清除能力的影响

2.2.2 光照条件

由表3结果可知，自然光下无花果提取物对DPPH平均清除能力（55.59%）明显高于避光条件下的平均清除能力（47.83%）。但是，避光条件下实验结果RSD=0.23%（n=3），在自然光条件下则为RSD=1.50%（n=3），这主要是因为DPPH溶液在避光条件下更稳定，因此本次实验仍选择在避光条件下进行。

表3 光照对无花果提取物DPPH清除能力的影响

2.2.3 反应温度

实验室室温为25 ℃，而DPPH的最佳保存条件为冷藏环境4 ℃，因此设置这两个温度来进行对比实验。由表3可知，25 ℃条件下无花果提取物的清除能力明显较高，而且在25 ℃条件下进行实验，有助于简化实验条件，因此本实验选择25 ℃为最佳反应温度。

表4 反应温度对无花果提取物DPPH清除能力的影响

2.3 无花果提取物清除DPPH能力比较

如图3所示，无花果提取物（黄酮）的浓度越高，样品对应的清除能力越强。表5数据表明，提取物浓度相同时，布兰瑞克无花果的DPPH清除能力最大。

图3 无花果品种对DPPH自由基清除能力的影响

表5 不同品种的无花果黄酮提取物对DPPH清除率的回归方程

3 结论

研究结果表明，DPPH在25 ℃避光条件下，反应时间30 min时，无花果提取物-DPPH反应体系较为稳定，适合实验研究。青皮、波姬红、布兰瑞克提取物（总黄酮）对DPPH的清除率的线性回归方程分别是：y=0.575x+0.123，y=0.585x+0.101，y=0.620x+0.158，R2均大于0.994。