灵芝深层发酵工艺优化及中药双向发酵

何伟，于淼，彭超，袁恺，朱威宇，丁子元，江俊杰，周卫强*

（1.中粮生物科技（北京）有限公司，北京 102209；2.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209；3.北京百奥茵诺生物科技有限公司，北京 102209）

灵芝（Ganoderma lucidum）属于真菌门、多孔菌 目、灵芝菌科、灵芝属，是一种大型药用真菌，最早被记载于《神农本草经》[1]。由于灵芝能预防或治疗多种疾病，在古代曾被称为“仙草”[2]。《本草纲目》中记载，灵芝可分为赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝和紫芝等，其中赤芝和紫芝在2000年被《中华人民共和国药典》首次收录，具有“补气安神，止咳平喘”的功能[3]。近年来，中国、东南亚国家及美国等地的许多学者对灵芝进行了深入研究，研究结果表明灵芝中含有如多糖、三萜、甾醇、核酸、蛋白质、多肽和脂肪酸等活性物质，其中灵芝多糖和灵芝三萜类这两类物质含量占比最高，同时也是灵芝具有药效的主要成分[4]。

灵芝液体深层发酵是通过将灵芝真菌接种至液体培养基中进行培养，使得灵芝在液体培养基中生长，并代谢合成一些生物活性成分，如多糖、灵芝酸等物质[5-6]。现代研究表明灵芝发酵液中富含多糖、灵芝酸等生物活性成分，常被用于保健品、化妆品领域[7-8]。

灵芝中药双向发酵技术是指以药用真菌灵芝菌为发酵菌株，将含有一定活性成分中药材作为发酵基质[9]。中药既能提供真菌生长所需营养，又能受到真菌中酶的作用改变中药自身成分，从而使整个发酵作用具有双向性[10]。在灵芝培养过程中，添加适量的中药材，如黄芪、山药、当归和薏米仁等，可以提高灵芝发酵的水平，从而促进灵芝发酵积累多种多量的生物活性物质[11-12]。众多研究表明，灵芝菌作为双向发酵菌种具有很强的优越性，以中药提取物、中药粉末或中药残渣为基质，以灵芝为发酵菌株进行组合发酵，能改变发酵体系中活性成分的含量和组成[13-14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝菌，保藏号：CICC14020、CICC14023。

玉米粉、淀粉，中粮生物科技股份有限公司；黄芪、当归、山药以及薏米仁，亳州市佗药堂药业有限公司；土豆粉，食品级，浙江中好邢食品添加剂有限公司。

葡萄糖，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酵母粉、蛋白胨、棉子蛋白胨、大豆蛋白胨以及酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；MaSO4·7H2O、K2HPO4，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T&J Btype型发酵罐，迪必尔生物工程（上海）有限公司；HZQ-F160型振荡培养箱，常州杰博森仪器有限公司；IMH100-SSS型恒温培养箱，美国ThermoFisher Scientific；SCB-1360超级洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；HWS28水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；X3R离心机，美国ThermoFisher Scientific；UV-1750紫外分光光度计，日本岛津；SX-700高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY。

1.3 培养基

1.3.1 固体培养基

采用土豆粉作为营养物质，制备PDA固体平板培养基。

1.3.2 种子液培养基

葡萄糖35 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、七水硫酸镁0.5 g/L以及维生素B10.1 g/L。

1.3.3 发酵培养基

（1）发酵基础培养基。葡萄糖35 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、七水硫酸镁1.0 g/L以及维生素B10.1 g/L。

（2）碳源筛选所用培养基。碳源以同等碳元素计分别选择葡萄糖、玉米粉液化液、玉米淀粉液化液以及玉米淀粉糖化液。

（3）氮源筛选所用培养基。氮源以同等氮元素计分别选择蛋白胨、酵母粉、蛋白胨和酵母粉复配、大豆蛋白胨、棉子蛋白胨以及酵母膏。

（4）碳氮比筛选所用培养基。固定碳元素含量，通过变化培养基中氮元素含量调整不同碳氮比，3种碳氮质量比分别为 15、 30和40。

（5）发酵条件优化所用培养基。葡萄糖35 g/L、酵母粉2.5 g/L、蛋白胨2.5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、七水硫酸镁1.0 g/L以及维生素B10.1 g/L。

（6）中药培养基。在优化后的培养基上分别添加黄芪、山药、当归或薏米仁各10 g/L。

1.4 灵芝菌种培养

1.4.1 平板菌种培养

取出保藏的菌种，在试管或平板上挑取一小块带有菌丝的琼脂放在新的培养基上，并在平板上标明接种日期和菌种编号放在（28±1）℃的恒温培养箱中恒温培养7 d左右。

1.4.2 种子液培养

从平板上挑取1 cm×1 cm大小的菌块，接种到摇瓶培养基中并加入配好的维生素B1溶液。将接种好的三角瓶放在28 ℃、200 r/min条件下培养7 d左右，得到成熟的种子液。

1.5 灵芝发酵工艺流程

灵芝发酵工艺流程图如图1所示。

图1 发酵工艺流程图

1.6 灵芝多糖检测

1.6.1 灵芝多糖的提取

采用乙醇溶剂对灵芝多糖进行提取[15]。

1.6.2 检测方法

采用硫酸-苯酚法进行显色反应对灵芝多糖进行检测，以无水葡萄糖作为标准品，制作标准曲线[16]。标准曲线方程为y=8.233 3x-0.000 6，其中y表示吸光度，x表示灵芝多糖含量（g/L），R2=0.999 5。

1.7 灵芝酸检测

1.7.1 灵芝三萜的提取

提取溶剂为正丁醇、料液比为1∶3（v∶v）、超声温度为50 ℃、超声时间为40 min及超声功率为120 W[17]。

1.7.2 检测方法

采用香草醛-冰醋酸显色反应对灵芝酸进行检测，以齐墩果酸作为标准品制作标准曲线[18]。标准曲线方程为y=0.910 2x-0.022 2，其中y表示吸光度，x表示灵芝酸含量（g/L），R2=0.999 6。

1.8 生物量检测

取发酵液样品35 mL与50 mL于离心管内，8 000 r/min离心10 min，倒去上清液，加入纯水充分混匀后再离心弃去上清液，重复此步骤2次，得到湿菌体，再将其放入80 ℃烘箱中烘24 h，对干菌体进行称重。

2 结果分析

2.1 不同碳源对灵芝发酵的影响

如表1所示，葡萄糖作为碳源时，干重含量最少，而玉米粉液化液作为碳源时，干重含量最高，这是因为玉米粉液化液中含有玉米粉颗粒，有利于灵芝菌丝的吸附生长，从而使得灵芝菌生长条件更好；淀粉液化液和淀粉糖化液的区别在于，糖化液中的还原糖占比高于液化液中的还原糖占比，在干重方面两者的影响差别不大；与单一的葡萄糖作为碳源相比，淀粉作为碳源时会促进灵芝菌体的生长。

表1 不同碳源对灵芝发酵的影响

从灵芝多糖含量的对比来看，玉米粉液化液作为碳源时，灵芝多糖含量相对较高；与葡萄糖相比，淀粉液化液作为碳源时，灵芝多糖含量相对较低。淀粉液化液与葡萄糖作为碳源，淀粉液化液中除含有葡萄糖外，还含有未被分解的二糖、三糖、糊精等物质，这些物质在灵芝生长过程中不被或者较难被利用，使得淀粉液化液作为碳源进行发酵的效果亚于葡萄糖作为碳源；相比淀粉，玉米粉液化后还具有多种微量元素，而这些微量元素可促进灵芝多糖的合成。

从灵芝酸整体来看，玉米粉液化液作为碳源时，灵芝酸含量最高；而以淀粉液化液和淀粉糖化液作为碳源时灵芝酸含量与葡萄糖作为碳源时的灵芝酸含量相近。

2.2 不同氮源对灵芝发酵的影响

如图2所示，从灵芝多糖含量来看，以酵母粉作为对照氮源，其中蛋白胨、棉子蛋白胨、大豆蛋白胨作为替代氮源与酵母粉的作用效果无明显差别；但酵母粉和蛋白胨复配后氮源与酵母粉相比，其对灵芝多糖的积累有促进作用；酵母膏作为氮源时不利于灵芝多糖的合成。

图2 不同氮源对灵芝发酵的影响

从灵芝酸含量来看，以酵母粉作为对照氮源，其中蛋白胨、酵母粉蛋白胨复合氮源、酵母膏、棉子蛋白胨以及大豆蛋白胨对灵芝酸都有促进作用，尤其是大豆蛋白胨作为氮源时对灵芝酸的积累促进作用更大。

2.3 不同碳氮比对灵芝发酵影响

如图3、4所示，从多糖指标出发，两株灵芝菌都表现出碳氮比太高或太低都会出现多糖含量少的情况；从干重来分析，都表现出随碳氮比的增加干重含量也减少的趋势。可能是因为当碳氮比太高时，氮源含量较少，不足以提供灵芝生长的营养需求，导致灵芝菌体生长受限，从而导致菌体生物量和灵芝多糖的合成都会减少；当碳氮比太低时，碳源含量一定的情况下，氮源含量较多，对灵芝发酵营养过剩，导致灵芝一直处于生长旺盛期，干重较高，相对之下灵芝多糖的合成减少。

图3 不同碳氮比对终点多糖影响

图4 不同碳氮比对终点干重影响

2.4 不同溶氧条件对灵芝发酵影响

发酵终点各参数数据如表2所示，从整体发酵周期来看，溶氧条件的变化对灵芝发酵周期影响很大，溶氧控制在20%时相对于不控制溶氧（对照）条件，发酵周期缩短67.5 h；对于灵芝多糖的影响，控制溶氧在10%以上时相对对照灵芝多糖含量有所增加，尤其是溶氧控制在20%时，灵芝多糖含量达到2.185 g/L，相比对照增加了0.818 g/L。通过生物量的变化可以发现，溶氧条件对灵芝菌体的生长影响很大，尤其是在溶氧条件不足的情况下，例如4#不控溶氧条件下，其菌体干重含量最少，而灵芝菌作为一种好氧真菌在缺氧的情况下会使其生长代谢受到影响，导致生长受限；从灵芝酸的变化来看，溶氧条件的变化对于灵芝酸的含量影响不大。

表2 发酵终点各参数

如图5所示，从灵芝多糖的变化趋势上来看，对照和控制溶氧条件对比，溶氧在10%以上时其多糖的变化趋势基本在同时间点出现转折，而不控溶氧条件下的多糖变化在前期变化缓慢，到发酵中后期才有积累的趋势；几个溶氧条件下，溶氧控制在20%左右时其灵芝多糖积累最多。

图5 不同溶氧条件下灵芝多糖变化趋势

2.5 不同中药成分对灵芝发酵的影响

2.5.1 不同中药成分对灵芝多糖含量的影响

如图6所示，分别添加黄芪、当归、山药以及薏米仁4种中药各10 g/L与对照进行对比，发现黄芪、山药、当归和薏米仁这几种中药对灵芝多糖的积累都有促进作用，尤其是黄芪作为中药基质添加到培养基中对灵芝多糖的促进效果更明显，使得灵芝多糖达到7.914 g/L，相比对照增加3.445 g/L。

图6 不同中药成分对灵芝多糖含量的影响

2.5.2 不同中药成分对灵芝酸含量的影响

如图7所示，黄芪、当归、山药以及薏米仁几种中药的添加对灵芝酸的积累都具有促进作用，尤其是黄芪的添加对其作用效果更为明显。在发酵培养基中添加10 g/L的黄芪可以促进灵芝酸的积累，使灵芝酸含量达到0.28 g/L，同比对照增加0.16 g/L，而其他3种中药对于灵芝酸的促进作用较小。

图7 不同中药对灵芝酸的影响

3 结论

上述实验结果表明，通过对灵芝发酵培养基及发酵条件的优化，得到酵母粉和蛋白胨复配作为氮源有利于灵芝多糖和灵芝酸的积累；玉米粉、葡萄糖作为碳源有利于灵芝多糖和灵芝酸的积累；通过碳氮比优化实验确定了C∶N（质量比）为30时更有利于灵芝发酵；发酵过程中，溶氧条件控制在20%左右时有利于灵芝发酵指标的增长；添加中药物质黄芪、当归、山药或薏米仁对于灵芝发酵都有促进作用，其中添加黄芪的发酵液中，灵芝多糖和灵芝酸含量都相对较高，而当归、山药、薏米仁3种中药相对于黄芪对灵芝多糖和灵芝酸的促进作用相对较弱。本文主要研究了灵芝多糖和灵芝酸的生产方法，为灵芝产物在生产中提供帮助；同时中药物质的添加，能促进灵芝中活性成分的增加，大大推动了灵芝发酵液在保健品和化妆品领域的应用。希望通过本文研究，为“中药双向发酵技术”的开发提供帮助。