虎杖解毒颗粒(无糖型)的药效毒理学研究

白雨鑫，童荣生，李晋齐，陈韵蓓

0 引言

虎杖解毒颗粒是四川省人民医院的医院制剂，已在临床应用30余年，清热、解毒疗效显著，广受患者好评，但其制剂辅料含大量蔗糖，易吸潮，不宜用于老年、糖尿病等禁糖患者，临床应用局限。虎杖解毒颗粒(无糖型)系在不改变原虎杖解毒颗粒方中药味、药量的基础上，将蔗糖替换为乳糖、甜菊素而制得的无糖剂型。本课题组前期已对虎杖解毒颗粒(无糖型)的成型工艺、质量标准等进行研究[1]。根据《药品注册管理办法》要求，临床前的药理、毒理研究结果是综合判断药物能否进入临床研究的重要依据之一。因此，本文对虎杖解毒颗粒(无糖型)、虎杖解毒颗粒的急性毒性和解热、抗炎情况展开研究，初步对比评价改制前后颗粒的有效性和安全性，为剂型改进的科学性、合理性提供依据。

1 实验材料

1.1 药物与试剂 虎杖解毒颗粒(无糖型)规格10 g/袋，相当于2.67 g生药/g颗粒，成人3次/d，1袋/次，成人按标准体重60 kg计算，即成人1.335 g生药/(kg·d)；虎杖解毒颗粒规格10 g/袋，相当于2.67 g生药/g颗粒，成人3次/d，1袋/次，即成人 1.335 g生药/(kg·d)；布洛芬片(安徽云鹏制药有限公司，批号：201420122，规格1 g，成人2 g/d)；醋酸地塞米松片(安徽金太阳生化药业有限公司，批号：130722，规格0.75 mg，成人2～4次/d，0.75～3.00 mg/次)；干酵母(英国OXIOD公司，批号：LP0021)；二甲苯(成都市科龙化工试剂厂，批号：20120721)。

1.2 动物 昆明种(KM)小鼠160只，体重 18～22 g (其中雄鼠120只，雌鼠40只)；SD雄性大鼠90只，体重 180～220 g，均由四川省医学科学院提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-15。所有动物实验前于四川省医学科学院实验动物中心适应性观察1周后使用。饲养环境：四川省医学科学院实验动物中心，湿度30%～50%，温度22～23 ℃。饲养方法：按组分笼饲养，雌雄分开，每笼5只，自由进食、进水。

1.3 实验仪器 欧姆龙 MC-142L型电子体温计(欧姆龙大连有限公司)；BP211D型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；鼠耳打孔器(上海玉研科学仪器有限公司)。

2 方法及结果

2.1 配置最大给药浓度的药液 称取50 g颗粒，按梯度少量多次地加入蒸馏水，不断搅拌，待颗粒溶解后，用灌胃针头吸取药液，以药液能通过灌胃针管为临界点，此时药液浓度为实验的最大给药浓度。上法确定虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒的最大给药浓度分别为2.43 g生药/ml、2.225 g生药/ml。

2.2 急性毒性实验(最大给药量实验)[2]

2.2.1 半数致死量预实验及结果 选取昆明种小鼠20只，雌雄各半。试验前小鼠禁食不禁水12 h，按体重随机分为虎杖组和虎杖(无糖)组，分别灌服虎杖解毒颗粒和虎杖解毒颗粒(无糖型)，以最大给药浓度和小鼠灌胃可承受的最大体积(40 ml/kg)进行灌胃，3次/d，每次间隔8 h，给药后自由进食和饮水，连续观察 7 d。结果小鼠无一死亡，未出现毒性反应，提示药品安全范围大，需进行小鼠的最大给药量实验。

表1 药物最大给药量实验的测定结果

2.3 抗炎药效-对二甲苯所致小鼠耳肿胀模型的影响实验[3-4]

2.3.1 实验方法 取体重18～22 g雄性昆明种小鼠80只，随机分为模型组，地塞米松组，虎杖高、中、低剂量组，虎杖(无糖)高、中、低剂量组，每组10只。配制浓度为0.1 mg/ml的地塞米松药液。根据“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表”，人∶小鼠=1∶9.01换算，计算出小鼠用药剂量的临床治疗等效剂量为12.03 g生药/(kg·d)，设定高、中、低3个剂量组小鼠给药剂量分别为26.7 g生药/kg、13.4 g生药/kg、6.6 g生药/kg，相当于人临床推荐每日用量的20倍、10倍、5倍。配制虎杖组和虎杖(无糖)组的高剂量(1.335 g生药/ml)、中剂量(0.67 g生药/ml)、低剂量(0.33 g生药/ml)药液。

各组小鼠均按20 ml/kg体积灌胃给药，1次/d，连续灌服给药4 d，模型组灌服等量的蒸馏水。第4天，给药后60 min，用移液枪吸取10 μl二甲苯涂于各组小鼠右耳的内外两面，左耳不涂作为对照。30 min后颈椎脱臼法处死小鼠，分别剪下左、右耳片，对齐，用直径9 mm的打孔器在耳片上固定位置打孔，得面积相同的耳圆片，迅速用电子天平称量。

表2 药物对二甲苯所致小鼠耳肿胀模型的影响

由表2可知，与模型组相比，地塞米松组、虎杖(高、中)组、虎杖无糖(高、中)组的肿胀度差异显著(P<0.05)，对炎症抑制作用强；虎杖(低)组、虎杖无糖(低)组的肿胀度较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，对炎症抑制作用不明显。同时，虎杖(无糖)组和虎杖组在所试剂量范围内，对二甲苯所致小鼠耳肿胀均有抑制作用，且抑制程度相近。

2.4 解热药效-对干酵母所致大鼠发热模型的影响实验[6]

2.4.1 实验方法 取体重180～220 g雄性SD大鼠80只，随机分为空白组、模型组、布洛芬组，虎杖高、中、低剂量组，虎杖(无糖)高、中、低剂量组，每组10只。配制浓度为0.016 7 mg/ml的布洛芬混悬药液[7]。

根据“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表”，人∶大鼠=1∶6.25换算，计算出大鼠用药剂量的临床治疗等效剂量为8.34 g生药/(kg·d)，设定高、中、低3个剂量组大鼠给药剂量分别为26.7 g生药/kg、13.4g生药/kg、6.6 g生药/kg，相当于人临床推荐每日用量的20倍、10倍、5倍。虎杖(无糖)、虎杖组的高剂量(1.335 g生药/ml)、中剂量(0.67 g生药/ml)、低剂量(0.33 g生药/ml)药液以及10%的干酵母混悬液[8]。

实验前6 h禁食不禁水，将受试大鼠的3次体温平均值作为基础体温，各组大鼠均按20 ml/kg体积灌胃给药，1次/d，连续灌服给药3 d，模型组灌服等量的蒸馏水。第3天给药后，立即在大鼠背部皮下注射10%干酵母混悬液10 ml/kg致热，在致热后1、2、4、6、8、12 h后，分别测量并记录各组大鼠体温[9]。

表3 药物对干酵母所致大鼠发热模型的影响

由表3、图1可知，与空白组比较，模型组在致热后1 h有明显降温，之后模型组升温明显(P<0.05)，说明造模成功。与模型组比较，在致热后的4、6、8 h，布洛芬组、虎杖(高)、虎杖无糖(高)组对干酵母致大鼠发热模型的解热作用较明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，虎杖(中、低)、虎杖无糖(中、低)组在致热后的各时段，解热作用不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。致热12 h后，模型组升温效果减弱，与各组差异减小。

图1 药物对干酵母所致大鼠发热模型的影响

结果表明，口服虎杖解毒颗粒(无糖型)、虎杖解毒颗粒对干酵母致热大鼠具有解热作用，其中高剂量的解热效果最好，中、低剂量的效果不明显。同时，两组实验颗粒各浓度的解热程度相近，说明制剂改制后，其解热疗效未受明显影响。

3 讨论

本实验为明确虎杖解毒颗粒(无糖型)、虎杖解毒颗粒的复方毒性，对制剂灌胃给药小鼠的急性毒性进行了研究，结果均未能测出其LD50，表明药品的毒性很小，进行最大给药量实验。已知按体重和日服生药量计算，若小鼠的最大给药量相当于临床成人日剂量的100倍以上，则说明药品较安全，可以提供临床应用[10]。在本文最大给药量实验中，颗粒用量分别相当于成人日剂量的218倍和200倍，结果小鼠无一死亡，生存状况无异常，提示药品毒性低，临床使用安全。

在抗炎药效研究实验中，选用地塞米松作为阳性对照药，以二甲苯为致炎剂，建立持久稳定且操作简便的小鼠耳肿胀模型，来验证药物的抗炎作用。该模型的作用机制是二甲苯可作用于血管，使毛细血管扩张，通透性增加，引起组织液大量渗出，局部红肿[11]。中药创新药物研发中，常以二甲苯诱发小鼠耳壳急性肿胀,模拟机体急性炎症的病理状态，以评价药物抗炎作用[12]。本研究结果表明，虎杖解毒颗粒(无糖型)、虎杖解毒颗粒对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制作用，且较模型组差异明显，肿胀抑制作用明显，为药品的抗炎作用提供了理论支持。

在解热药效研究实验中，选用布洛芬作为阳性对照药，以干酵母为致热剂，建立大鼠发热模型，实验要求低且成功率高，其中干酵母的致热成分是全菌体及菌体内所含的荚膜多糖和蛋白质。干酵母所致的发热是由于注射部位的局部溃烂引发的剧烈炎症反应,是最常用的大鼠发热模型[13]。已知皮下注射干酵母混悬液，注射初期体温下降，2～3 h开始升温，6～7 h达峰值，升温持续20 h，本实验造模成功。结果表明，虎杖解毒颗粒(无糖型)、虎杖解毒颗粒均可缓解干酵母引起的大鼠发热反应，其中高剂量组[26.7 g生药/(kg·d)]在大鼠致热后4～8 h有明显的降温作用，且降温幅度相近。

本实验研究证明，虎杖解毒颗粒(无糖型)、虎杖解毒颗粒毒性均较低，具备一定解热、抗炎作用。同时，制剂改制前后急性毒性及药效强度未发生明显改变，结合课题组前期实验证明改制前后制剂质量标准、指纹图谱共有模式基本一致，证明了更改辅料对本制剂处方中的化学成分、物质基础基本没有影响。

本研究通过大量实验结果表明，虎杖解毒颗粒(无糖型)的工艺稳定、质量可控、安全有效，为该制剂研发的科学性、合理性提供了依据。