菊粉在快速检测饲料大肠菌群试纸片中的应用

孙丙坤，张 萌，王殷霞，李 宁，乔 艺，解瑞宁，王文军，姜 建*

（1.济宁医学院 公共卫生学院，山东济宁 272013；2.济宁医学院 护理学院，山东济宁 272013）

细菌在自然界分布广泛，很多细菌对人们的生产生活至关重要。随着社会的发展，饲料安全卫生越来越受到广大人民群众的重视，而单位体积内的大肠菌群数量又是判别饲料是否安全卫生的一个重要指标（Tominaga，2019；郭佳琦，2018）。

菊粉一直被认为是难降解的碳水化合物之一，其最早是在植物中提取出来的，是植物储备性碳水化合物。在天然植物中，菊芋中的菊粉含量最高，菊粉也因此得名（马草，2021）。由于菊粉在水中的溶解度较高，可以加入到不同细菌培养基中且不影响培养基的组分，不会产生沉淀等问题（黄兴成等，2020）；与此同时，把菊粉添加到培养基中会选择性的促进相关菌群增值（徐静静，2021）。因此，利用菊粉可以选择性的对菌群进行增殖这一特点（曾文静，2021），把菊粉加入到大肠菌群检测试剂中，以期提高大肠菌群快速检测试纸片的灵敏度。大肠菌群快速检测纸片可以快速、简便的鉴定和分析饲料中大肠菌群的数量（Alles等，2018）。饲料中大肠菌群一旦超标，会丢失饲料的营养成分，从而失去价值。畜禽食用微生物超标严重的饲料容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害畜禽健康（Grigori等，2018）。

本文评价菊粉在大肠菌群试纸片中的相关作用，以期提高大肠菌群试纸片的灵敏度和准确性，为大肠菌群试纸片在饲料安全快速检测领域中的运用奠定一定的基础（唐漪灵等，2000）。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂原料：大肠埃希氏菌ATCC25922、大肠埃希氏菌BNCC-336902：为实验室保留菌种，济宁医学院公共卫生学院饲料安全技术教研室提供；5cm×5cm滤纸片若干：杭州市富阳北木浆纸有限公司、抚顺市民政滤纸厂、美国伯乐Bio-Rad公司；3号自封袋（7×10×12）：浙江亚峰包装有限公司；400目304不锈钢滤网（30 um孔距）：江苏蕾蔻金属制品公司。

试剂：牛肉膏（北京陆桥技术有限责任公司）；胰蛋白胨（北京陆桥技术有限责任公司）；氯 化 三 苯 四 氮 唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；菊粉（食品级，上海如吉生物科技发展有限公司）；饲料（河南联合英伟饲料有限公司）；高压灭菌水。

1.2 仪器与设备LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；JA3003N电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；PYL-70恒温培养箱（天津市莱玻特瑞仪器设备公司）；净SW-CJ-2FD化工作台（苏州净化设备有限公司）；HNY-2102C恒温培养振荡器（天津市欧诺仪器仪表有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 大肠菌群悬液的制备 利用实验室保留菌种大肠埃希氏菌ATCC25922、大肠埃希氏菌BNCC-336902单菌落分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在37℃下培养24 h后为大肠菌群悬液。将大肠菌群悬液进行过梯度稀释后，将两株大肠埃希氏菌按照1：1比例混合，最终稀释为100 CFU/mL的标准菌悬液，此浓度菌液为大肠菌群标准悬液。

1.3.2 滤纸片的筛选 快速检测纸片法是将选择性培养基和目标菌株的显色底物混合后依附于滤纸片上，制成检测纸片，菌体通过吸收滤纸片的培养基从而生长繁殖，滤纸片的种类决定培养基吸附量，最终决定纸片的显色程度。

1.3.3 试纸片制备条件的确定

1.3.3.1 试纸片制备时间的确定 将培养基内分别加入适量的溴甲酚紫母液和TTC母液，使溴甲酚紫溶液和TTC溶液的终浓度分别为80和90 mg/L。混合均匀后，浸泡灭菌过的滤纸片数分钟，小风烘干 2、4、6、8 h，装至自封袋内备用。

1.3.3.2 TCC浓度的确定 取上述1.3.3.1中的培养基分别加入适量的溴甲酚紫母液，使溴甲酚紫溶液终浓度为80 mg/L，TTC的最终浓度分别为 66、133、266、327 mg/L。

1.3.3.3 菊粉添加量的确定 将培养基分别加入适量的溴甲酚紫母液和TTC母液，使得溴甲酚紫溶液和TTC溶液的终浓度分别为80和133 mg/L。按照比例加入菊粉，使得菊粉终浓度为 0‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰进行添加。

1.3.4 大肠菌群试纸片的性能评价

1.3.4.1 试纸片重复度评价 将阳性大肠菌群标准菌悬液分别添加到3个大肠菌群试纸片中，使待测样品终浓度保持在10～200 CFU/mL之间，每个稀释度3张试纸片，试纸片过夜培养后，根据国家标准GB/T18869-2019饲料中大肠菌群的测定（刘德阳等，2013），查附录D中的大肠菌群最可能数（MPN）检索表进行记录。

1.3.4.2 试纸片准确度评价 将阳性大肠菌群标准菌悬液稀释到102CFU/mL后，分别随机添加到全价饲料、猪浓缩饲料、产蛋鸡浓缩饲料等5种饲料中，将待测样本进行 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释，挑选3个合适的稀释度，利用国标法、本实验室研发大肠菌群试纸片法和市售大肠菌群试纸片进行菌落计数，最后进行统计分析。

1.3.5 数据处理 本试验使用SPSS15.0统计软件进行分析处理，灵敏度检测结果采用t检验，以P＜0.05表示差异显著（李恒等，2020）。

2 结果与分析

2.1 试纸片制备条件由表1可知，选用的滤纸材料为慢速厚滤纸。试纸片干燥2 h时，由于干燥时间短，试纸片阳性菌落出现严重蔓延，无法识别。随着干燥时间的延长，试纸片性能非常稳定，试纸片最佳的干燥时间为6 h。TTC浓度在66～327mg/L范围内，在同一稀释倍数下，菌落总数最多（表2）。因此，细菌总数检测纸片法的最佳浓度约为133 mg/L。

表1 同滤纸大肠菌群菌落数量（CFU）

表2 TTC最佳浓度的确定 mg/L

2.2 不同菊粉浓度对大肠菌群试纸片的影响由图1可知，菊粉添加量分别为0‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰的质量体积比。菊粉可以在试纸片表面形成一层凝胶，可让试纸片更好的发挥作用。由图2可知，添加菊粉的大肠菌群试纸片灵敏度明显高于没有添加菊粉的大肠菌群试纸片，试纸片加入菊粉后，菊粉本身具有一定的凝胶作用，纸片由于吸附培养基较多，营养充足，可以使更多的大肠菌群形成红色斑点，当添加菊粉后，红点较多且较大。随着菊粉添加量逐渐增加，菊粉本身对大肠菌群有一定的抑制作用，试纸片中的菌落数又有所降低。

图2 不同菊粉浓度对试纸片的影响

2.3 大肠菌群试纸片的重复度和准确度评价对大肠菌群试纸片进行10次重复试验，加入菊粉的大肠菌群试纸片重复度很好，最终样品中的大肠菌群MPN值很稳定。根据大肠菌群试纸片的准确度评价，表3中自研的大肠菌群试纸片与市场中的3M大肠菌群试纸片进行比较，加入菊粉的大肠菌群试纸片在阳性样本检出率明显高于3M PetrifilmTM品牌。对比国标发酵管法，在检测全价饲料、猪浓缩饲料中的准确度达100%。与国标发酵管法相比，55个阳性样本中检测一致的是52个，符合率为94.5%。

表3 大肠菌群试纸片准确度评价结果

3 讨论

本次研发的大肠菌群试纸片是以滤纸吸收培养基、凝胶、指示剂为载体，通过培养细菌显色来检测样品中的微生物。在生产工艺方面探索了滤纸种类对大肠菌群试纸片的影响，发现慢性厚滤纸片是培养基最好的吸附载体。在培养基组分方面，试纸片中添加菊粉后，试纸片的灵敏度有较大幅度的提升，由于菊粉本身具有一定的凝胶作用，会使红点不易晕开，又由于菊粉的加入使得纸片吸附更多的培养基，导致纸片上营养充足，可以让更多的大肠菌群形成红色斑点。在实际检测过程中，经过多次优化，确定1 mL为最佳加样量。按照试纸片正常的生产程序，本次添加了菊粉的纸片存放9个月仍不失效，故纸片保质期在6个月。

4 结论

大肠菌群试纸片分别在生产工艺和培养基组分这两个方面进行改进，发现菊粉添加到大肠菌群试纸片中可以明显提高饲料大肠菌群试纸片的灵敏度和准确性，与市面大肠菌群试纸片相比，加入菊粉后试纸片阳性饲料样本检出率明显提高，符合率达94.5%。