白藜芦醇改善野百合碱所致大鼠肝损伤机制的初步研究

卫 霞，宋育林，涂倩倩，徐 魁

在中国，土三七等中草药是肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS)的主要致病因素[1]。HSOS确切的发病机制不明，目前认为谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭[2]、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[3]等均与其相关。白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种多酚类物质，多种植物中存在，被认为是沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的一种有效的激活剂[4]，具有激活SIRT1、抗氧化、抗炎等多个方面的作用[4-5]，并在多种肝脏疾病中具有保护肝脏作用[5]。白藜芦醇被证实能够通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路来减轻肝脏缺损再灌注损伤[6]，但其在HSOS的发病过程中能否发挥作用目前尚未可知。为此，本研究通过建立野百合碱(monocrotaline,MCT)导致的HSOS大鼠模型，探讨对白藜芦醇对MCT所致的大鼠HSOS的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物32只健康雄性Sprauge-Dawley(SD)大鼠，等级：SPF级，6周龄，重量(210±30)g，购于北京斯贝福公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。

1.2 主要实验试剂及仪器野百合碱、白藜芦醇均购自美国MCE制药有限公司；丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒为罗氏诊断产品(上海)有限公司生产，总胆红素(total bilirubin,TBiL)检测试剂盒为上海科华生物工程股份有限公司产品；GSH试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所制造；SIRT1、HIF-1α、VEGF、GAPDH抗体均购自合肥朵能生物科技有限公司(货号：AB0208501、AB0146701、AB013301、AB010301)；二抗系Proteintech公司产品[山羊抗小鼠二抗货号：SA00001-1；山羊抗兔二抗货号：SA00001-2]。Roche Cobas 8000全自动生化分析仪购自瑞士Roche公司；酶标仪产自美国Thermo公司；紫外可见分光光度计购于上海菁华公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自Solarbio公司；垂直、转移电泳槽均购于上海天能公司；化学发光成像分析系统ZF-670产自上海嘉鹏公司。

1.3 实验方法32只雄性SD大鼠随机分为三组：对照(Control)组8只、野百合碱(MCT)组12只，白藜芦醇(RES)组12只。MCT组和RES组均给予MCT 160 mg/kg单次灌胃，对照组给予相应剂量的溶剂灌胃处理，RES组于灌胃前1 d起每天予以RES溶液30 mg/kg腹腔注射给药；对照组和MCT组予以相应剂量的溶剂进行相同处理。所有大鼠在行MCT灌胃处理2 d后处死。处死前予以隔夜禁食，称重后麻醉处理，再腹主动脉采血和取出肝脏。全血室温下静置2 h后离心，提取上层血清-80 ℃冰箱冻存。肝脏取出后称量肝湿重，计算肝指数(%)=(肝脏湿重/处死前大鼠体质量)×100%，10%福尔马林缓冲液固定的部分肝左叶留做病理学检查，余肝脏组织于液氮中暂存，后转移至-80 ℃冰箱贮存。

1.4 肝功能指标检测全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT、AST、TBiL水平。

1.5 肝组织匀浆检测GSH、MDA含量剪取一定量的肝组织，洗涤干净后每克组织加入9ml的0.9%氯化钠溶液，冰浴条件下制备10%肝组织匀浆，离心后提取上清液，-20 ℃冰箱保存待测。按照试剂盒说明书步骤操作，分别采用微板法和硫代巴比妥酸法检测GSH和MDA，考马斯亮兰法测定肝组织总蛋白。

1.6 HE、Masson染色观察肝组织形态经福尔马林固定的肝组织经常规脱水、包埋、切片后按步骤行HE和Masson染色。于电子显微镜下观察并拍照，按Dleve[7]病理评分标准打分，根据各项积分之和分为轻、中、重度HSOS。

1.7 蛋白免疫印记法检测肝组织中SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平取部分大鼠肝组织匀浆，离心，提取总蛋白，后按步骤行凝胶电泳，再经电转与封闭，一抗及相应浓度分别为：SIRT1抗体(1 ∶250)、HIF-1α抗体(1 ∶250)、VEGF抗体(1 ∶200)。4 ℃环境下孵育过夜，二抗于室温下孵育2 h，以GAPDH(1 ∶2 000)作为此次实验的内参，使用化学发光仪显影，Image J软件分析所获得的数据,结果以光密度值比值(目的蛋白/内参蛋白)形式表示。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及肝指数变化在实验期间，与Control组大鼠相比，MCT组和RES组大鼠逐渐出现不同程度的食欲减退、行动缓慢、毛色暗淡、反应迟钝，解剖后可见肠道淤血水肿及腹腔积液，且MCT组大鼠较RES组整体情况更差，至实验结束，各组均无大鼠死亡。MCT组大鼠处死前体质量、肝湿重及肝指数较Control组均有所增加(P<0.01)，RES组三种指标均较MCT组有所减少(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠重量情况变化

2.2 各组大鼠血清肝功能变化与Control组相比，MCT组大鼠ALT、AST、TBiL均有所升高(均P<0.01)，而在使用RES干预后各指标均有降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠各组大鼠血清ALT、AST、TBiL变化

2.3 各组大鼠肝组织氧化应激相关指标GSH、MDA的变化与Control组相比，MCT处理后大鼠肝脏组织中GSH下降，MDA上升(均P<0.01)。使用白藜芦醇干预后GSH水平提高，MDA水平降低(均P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠肝组织GSH、MDA变化

2.4 各组大鼠肝脏病理损伤变化Control组大鼠肝脏HE和Masson染色所见结构符合正常大鼠肝脏病理表现，肝小叶结构完整。MCT组大鼠可见肝窦淤血扩张、中央静脉内皮损伤、内皮下出血及胶原纤维沉积，肝细胞出现变性、坏死及排列紊乱。RES组大鼠肝脏病理变化较MCT组得到改善，本实验表明使用白藜芦醇处理能有效减轻HSOS的严重程度。见表4、图1。

表4 各组大鼠肝组织病理评分

图1 各组大鼠肝脏病理变化情况 HE染色和Masson染色 ×400

2.5 各组大鼠肝脏SIRT1、HIF-1α以及VEGF蛋白表达水平与Control组相比，MCT组大鼠肝脏SIRT1蛋白表达减少，而HIF-1α和VEGF蛋白的表达增加(均P<0.01)。与MCT组比较，RES组中，SIRT1蛋白增多，HIF-1α和VEGF蛋白含量减少。见图2。

图2 各组大鼠肝组织SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表达情况

3 讨论

HSOS是一种终末肝小静脉闭塞性小静脉炎，病理表现主要为肝窦和中央静脉向心性、非血栓性阻塞，临床表现与其他类型肝脏疾病相似，缺乏特异性[8]。中国引起HSOS的常见药物有土三七等，其主要致病成分为吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids,PAs)，PAs-HSOS在不同疾病阶段具有不同的病理表现，最初可见肝窦Ⅲ区内皮细胞损伤、坏死和脱落，并与血液中的红、白细胞共同沉积于Disse腔隙，使小静脉管壁增厚，管腔变窄和闭塞，又被称为肝小静脉闭塞症，后期大量细胞外基质沉积，引起肝血窦和小静脉的胶原纤维化[2]。关于PAs-HSOS动物模型的建立，目前最常用的方法为MCT 160 mg/kg单次灌胃法[9]。该实验中，采用MCT 160 mg/kg单次灌胃后检测大鼠血清肝功能指标异常，肝脏病理出现细胞排列紊乱，其间伴有变性、坏死，肝窦出现淤血扩张，合并有中央静脉内皮损伤，与文献[9]报道的损伤表现相符，表明本实验成功复制出MCT诱导的大鼠HSOS模型。

VEGF与细胞表面受体结合后发挥调节内皮细胞的通透性的作用，并有利于内皮细胞的增殖、迁移和存活[10]。在使用土三七造模的小鼠实验中，可以观察到VEGF蛋白和mRNA表达水平较正常组均有所提高[3]，该实验中，MCT组大鼠VEGF表达含量较Control组增加，说明VEGF参与PAs-HSOS发病过程。Mizrahi et al[11]的实验观察到使用人源化的VEGF单克隆抗体-贝伐单抗干预，可以减轻奥沙利铂诱导的肝窦内皮细胞损伤，提示抑制VEGF可能对HSOS具有保护作用。

SIRT1主要存在于细胞核中，在体内广泛表达，通过去乙酰化各种组蛋白/非组蛋白的赖氨酸残基来调控多种基因表达，做为SIRT1激动剂，白藜芦醇能够在体内环境中促进SIRT1与底物分子结合，从而增强其去乙酰化能力[12]。SIRT1能够在Lys709位置上去乙酰化抑制HIF-1α的表达，使HIF-1α去乙酰化失活，从而参与调控氧化应激、细胞凋亡、能量代谢等多个过程，发挥其重要作用[13]。活性HIF-1α分子能够激活VEGF并使其稳定表达，在血管形成的过程中发挥重要调节作用[14]。在一项缺血再灌注性肝损伤研究[6]中，于再灌注前30 min对大鼠行白藜芦醇预处理，观察到HIF-1α、VEGF的表达被抑制，结合血清学指标检测及病理学观察大鼠肝损伤得到改善。该实验中，白藜芦醇组大鼠的SIRT1表达水平较MCT组提高，同时HIF-1α和VEGF的表达减少，大鼠肝功能损伤指标有所好转，病理损伤程度改善，说明白藜芦醇能够通过上调SIRT1的表达，抑制HIF-1α/VEGF信号通路对MCT所致的HSOS起保护作用。

目前认为PAs经胃肠道吸收后主要被肝脏内细胞色素P40酶系代谢，其代谢产物与GSH结合后解毒，或蛋白质反应生成毒性吡咯蛋白加合物；肝窦内皮细胞内的GSH含量较低，容易受到反映性代谢产物的影响，导致GSH严重消耗和吡咯蛋白加合物生成增加[2]。在该实验中，野百合碱处理后大鼠肝组织匀浆检测GSH较Control组降低，MDA升高，说明GSH不足引发的氧化应激损伤是HSOS的重要发病机制。通过抑制氧化应激损伤，提升肝细胞内的GSH水平能够有效减轻野百合碱诱导的HSOS[15]。该实验发现，在使用白藜芦醇干预后，肝功能损伤相关指标下降，大鼠肝组织GSH水平提高，MDA降低，HSOS病理学评分也有所改善，说明白藜芦醇可以通过升高肝脏GSH水平、减少MDA的表达，保护野百合碱引起的肝损伤。

综上，本研究表明，白藜芦醇能够通过增加SIRT1的表达，抑制HIF-1α/VEGF信号通路及抗氧化应激损伤来保护MCT引起的大鼠肝损伤，这将为有效防治含PAs的中草药引起的肝损伤提供重要的理论依据和治疗靶点。