褪黑素调控NLRP3/caspase-1通路减轻脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞损伤

王齐 罗松 李亮

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种严重肺部炎症性疾病，其病理特征主要为肺泡上皮细胞损伤，其病情进展迅速，死亡率高达30%～40%，是重症监护室患者死亡最主要的原因之一，目前尚无确切疗效的治疗药物，因此，寻找ALI的治疗药物、研究其作用机制对改善ALI患者的预后具有重要意义[1,2]。褪黑素是一种内源性神经激素，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种药理学作用，可参与调控多种炎症性疾病[3]。研究显示，褪黑素可减轻脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤，但是褪黑素对减轻ALI的具体作用机制尚不清楚[4]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体是一种蛋白质复合物，可激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)，形成NLRP3/caspase-1信号通路，该通路的激活参与ALI的炎性反应[5]。但是，目前NLRP3/caspase-1信号通路在褪黑素对LPS诱导的A549细胞中的作用尚不清楚。因此，本研究通过观察褪黑素对LPS诱导的A549细胞凋亡及NLRP3/caspase-1通路的影响，初步探索褪黑素对LPS诱导的A549细胞损伤机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人肺泡上皮细胞(A549)购自中科院上海细胞库，褪黑素、噻唑蓝(MTT)试剂盒、LPS购自美国Sigma公司；MCC950购自美国MedChem Express公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自大连宝生物科技有限公司；NLRP3、caspase-1及内参GAPDH引物由上海生工生物工程科技有限公司设计与合成；人肿瘤坏死因子-α(TNF-α) ELISA试剂盒、白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒购自美国Elabscience公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、RIPA裂解液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人NLRP3、caspase-1和鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组:常规复苏A549细胞后，接种在含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基培养，每隔2～3 d换液传代培养，收集对数生长期细胞，将A549细胞随机分成对照组、LPS组、LPS+褪黑素组(LPS+MT组)、LPS+抑制剂组，其中LPS组使用10 mg/L LPS诱导12 h；LPS+MT组使用800 μmol/L褪黑素预处理4 h，10 mg/L LPS诱导12 h；LPS+抑制剂组使用10 μmol/L MCC950预处理30 min，10 mg/L LPS诱导12 h。本实验中褪黑素、LPS使用浓度分别参照文献[6,7]中所用浓度。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性:将处理后的各组A549细胞，制备成4×105个/ml的单细胞悬液，以每孔200 μl接种于96孔板中，培养24 h，每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后，再加入150 μl的DMSO，于酶标仪波长490 nm处测定各孔光密度(OD)值。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡:取各组处理后的A549细胞，使用AnnexinV binding buffer将细胞调整成2×105个/ml的细胞悬液，每孔加入PI染液和RnaseA，避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。另取各组细胞分别加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI溶液，混匀后，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平:取处理后的各组细胞培养上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 RT-qPCR实验检测细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA水平:采用RT-qPCR检测各组细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达量。Trizol试剂提取各组细胞总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA后，进行RT-qPCR扩增。NLRP3上游引物序列(5’-3’)：CGTGAG

TCCCATTAAGATGGT，下游引物序列(5’-3’)：CCCGA

CAGTGGATATAGAACAGA；caspase-1上游引物序列(5’-3’)：ACAAGGCACGGGACCTATG，下游引物序列(5’-3’)：TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG；GAPDH上游引物序列(5’-3’)：AGACAGCCGCATCTTCTTGT，下游引物序列(5’-3’)：CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达量。

1.2.6 Western blot法检测细胞中NLRP3、caspase-1蛋白表达:提取各组A549细胞总蛋白，取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜，使用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，分别加入兔抗人NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)和鼠抗人β-actin(1∶500)抗体，4℃孵育过夜，PBST缓冲液洗膜3次，再对应加入HRP标记的IgG(1∶2 000)二抗，室温孵育2 h，洗膜显色，凝胶成像仪中成像，以β-actin为内参，采用Image J软件分析各蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 褪黑素对LPS诱导的A549细胞增殖活性的影响 与对照组比较，LPS组A549细胞OD值显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+MT组与LPS+抑制剂组细胞OD值明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 褪黑素对LPS诱导的A549细胞增殖活性的影响

2.2 褪黑素对LPS诱导的A549细胞周期的影响 与对照组比较，LPS组A549细胞G0/G1期比例显著升高，S期、G2/M期比例降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+MT组与LPS+抑制剂组细胞G0/G1期比例显著降低，S期、G2/M期比例升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2。

对照组LPS组LPS+MT组LPS+抑制剂组

表2 褪黑素对LPS诱导的A549细胞周期的影响

2.3 褪黑素对LPS诱导的A549细胞凋亡的影响 与对照组比较，LPS组A549细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，而LPS+MT组和LPS+抑制剂组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与LPS组比较，LPS+MT组与LPS+抑制剂组细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2，表3。

对照组LPS组LPS+MT组LPS+抑制剂组

表3 褪黑素对LPS诱导的A549细胞凋亡的影响

2.4 褪黑素对LPS诱导的A549细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响 与对照组比较，LPS组A549细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+MT组与LPS+抑制剂组A549细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 褪黑素对LPS诱导的A549细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响

2.5 褪黑素对LPS诱导的A549细胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达的影响 与对照组比较，LPS组A549细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+MT组与LPS+抑制剂组细胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5，图3。

表5 4组A549细胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达

图3 4组A549细胞中NLRP3、caspase-1蛋白表达情况；A 对照组；B LPS组；C LPS+MT组；D LPS+抑制剂组

3 讨论

褪黑素是由松果体分泌的神经内分泌激素，具有抗炎、抗氧化、增强免疫、抗肿瘤活性，在保护神经损伤、肺损伤、血管内皮损伤等方面发挥重要作用[8,9]。Ding等[6]研究表明，褪黑素可通过PI3K/GSK-3β轴上调Nrf2，抑制LPS诱导的人肺泡上皮细胞形态改变和细胞上皮间质转化，并减少活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平，进而保护人肺泡上皮细胞免受氧化应激损伤。关信民等[10]研究表明，褪黑素可通过激活Akt/mTOR通路减轻同型半胱氨酸(Hcy)诱导的冠状动脉内皮细胞损伤。本研究结果显示，LPS诱导的A549细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例显著降低，G0/G1期比例、细胞凋亡率明显升高；而进一步使用800μM褪黑素处理细胞后，A549细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例升高，G0/G1期比例、凋亡率显著降低，表明褪黑素可显著抑制LPS诱导的A549凋亡，并促进其增殖。马一闻等[11]研究表明，褪黑素通过抑制JAK-STATs信号通路，明显抑制神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶脱氢物(MPP+)诱导小鼠嗜铬细胞瘤细胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A的表达。另有研究显示，在自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中，褪黑激素可通过减少促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和增加抗炎细胞因子IL-4、IL-10水平来减轻神经性炎症[12]。本研究结果显示，LPS诱导的A549细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，而进一步使用800 μmol/L褪黑素处理后，细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低，表明褪黑素可抑制LPS诱导的A549细胞炎性因子的释放，减轻LPS所致A549细胞炎症损伤。但是褪黑素对减轻LPS诱导的A549细胞损伤的作用机制尚不清楚。

NLRP3炎性小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和caspase-1组成，活化的NLRP3炎性小体可激活pro-Caspase-1产生有活性的caspase-1，形成NLRP3/caspase-1信号通路，通过多种信号激活从而产生炎性因子IL-1β和IL-18，扩大炎性反应，导致组织损伤，研究表明，NLRP3/caspase-1信号通路在肿瘤、炎症性疾病、呼吸系统等疾病中发挥重要的调控作用[13,14]。刘瑞莲等[15]研究表明，利多卡因通过抑制P2X7R/NLRP3/caspase-1信号通路，减轻ALI大鼠的肺水肿程度，改善肺组织病理损伤程度，降低炎性因子水平。白鑫宇等[16]研究发现，在卵清蛋白所致的支气管哮喘小鼠模型中，加味五味石膏汤可通过调节Th1/TH2免疫失衡及抑制NLRP3/caspase-1信号通路对支气管哮喘起治疗作用。王栋等[17]研究表明，脑心通可通过抑制NLRP3/Caspase-1通路而显著抑制LPS诱导的小胶质细胞焦亡。以上研究表明，抑制NLRP3/Caspase-1通路可减轻炎性反应对组织和细胞造成的损伤。本研究发现，使用LPS诱导后的A549细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著升高，提示LPS可能激活NLRP3/caspase-1信号通路；进一步使用褪黑素或NLRP3抑制剂处理以后，细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著降低，提示褪黑素与NLRP3抑制剂的作用效果类似，褪黑素可能通过抑制NLRP3/caspase-1信号通路，减轻LPS诱导的A549细胞损伤。

综上所述，褪黑素可能通过抑制NLRP3/caspase-1信号通路，抑制LPS诱导的A549细胞炎症损伤。但本研究局限于NLRP3/caspase-1信号通路相关因子，未对炎症通路进行全面验证，仍需做进一步研究。