脂肪酶Rhizopus chinensis催化水解大豆粉末磷脂制备L-α-甘油磷脂酰乙醇胺

李 红，李子怡，张丽霞，张康逸，申瑞玲，魏 涛

(1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，郑州 450000; 2.河南省农业科学院 农副产品加工研究中心，郑州 450002)

L-α-甘油磷脂酰乙醇胺(L-α-GPE)是生物膜主要组分脑磷脂(PE)、磷脂酰胆碱等的前体物质[1-2]，主要存在于猪、兔、牛等动物的肝、脾、肾和脑中[3-4]，在磷脂的生物合成和乙醇胺的释放中起重要作用。已有研究证明，L-α-GPE对治疗老年性脑病变、退化性和脑瓣膜功能不全等病症(如精神活动减慢、记忆力减退、情绪低落等)具有一定疗效[5-7]，这促使人们探索其作为医药和食品添加剂的可行性。

目前，L-α-GPE主要通过从生物组织器官中提取[8]、水解缩醛磷脂[9]、化学合成[10]和醇解蛋黄磷脂或大豆粉末磷脂[11]等方法制备。然而，使用这些方法制得的L-α-GPE在产品纯度、比旋光度和环境污染等方面都存在一定问题。如：从生物组织器官中提取受原料的限制，难以工业化生产；缩醛磷脂在水解过程中由于使用一定配比的醋酸、盐酸和氯化汞作为酸性催化剂会引起设备腐蚀和重金属污染问题[9]；醇解蛋黄磷脂或大豆粉末磷脂的L-α-GPE得率、纯度相对较低。脂肪酶催化水解磷脂制备L-α-GPE具有催化效率高、反应条件温和、设备要求不高、生产成本低等优势，备受关注。本课题组曾以脂肪酶Thermo4S-3为催化剂，研究了水相体系中水解大豆粉末磷脂制备L-α-GPE，得率达93.6%[12]。脂肪酶Rhizopuschinensis(三酰甘油酰水解酶，E.C.3.1.1.3)作为催化剂，在结构脂的制备中得到广泛应用[13]。然而，脂肪酶Rhizopuschinensis水解大豆粉末磷脂制备L-α-GPE的研究未见报道。基于此，本文采用脂肪酶Rhizopuschinensis催化水解大豆粉末磷脂制备L-α-GPE，通过单因素实验优化了脂肪酶Rhizopuschinensis催化制备L-α-GPE的工艺条件，并对其进行分离纯化和结构鉴定，以期为工业制备L-α-GPE提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

大豆粉末磷脂(食品级，磷脂含量96%，主要成分为15%磷脂酰胆碱、20%磷脂酰乙醇胺、20%磷脂酰肌醇、5%磷脂酸)，天津博帅工业贸易有限公司；PE和L-α-GPE标准品、色谱级氯仿和甲醇，Sigma公司；脂肪酶Rhizopuschinensis(酶活力9 000 U/g)，江南大学生物工程实验室赠送；离子交换树脂，苏青集团；柱层析用硅胶〔0.075～0.150 mm(100～200目)，含水量3%〕，青岛海阳化工有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

RE-52 旋转蒸发仪，JJ-1B 强力恒速电力搅拌器，HH-4 数显恒温水浴锅，AR2140 电子精密天平，Waters 1525 HPLC，Waters 2424 ELSD 检测器，470 Nicolet ATR-FTIR傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪，Waters Synapt Q-TOF超高效液相色谱电喷雾四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)仪。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酶Rhizopuschinensis催化水解大豆粉末磷脂制备L-α-GPE

称取一定量大豆粉末磷脂于50 mL 三颈圆底烧瓶，加入10 mL一定pH的磷酸盐缓冲溶液，在一定温度、450 r/min转速下磁力搅拌20 min制成大豆粉末磷脂溶液，再添加一定量的无水CaCl2和脂肪酶Rhizopuschinensis进行水解反应15 h。反应完成后，水解液于80℃下真空浓缩后得到浓缩液。将浓缩液溶于相同体积氯仿-甲醇(体积比2∶1)溶液中，10 000 r/min 离心5 min，取上清液测定L-α-GPE纯度，并参照文献[12]计算L-α-GPE得率。

1.2.2L-α-GPE纯度的测定

采用HPLC-ELSD测定L-α-GPE的纯度。HPLC-ELSD 条件：Lichrospher Si column硅胶柱(25 cm×0.46 cm, 5 μm) ，柱温 35℃；进样量5 μL；流速 0.97 mL /min；采用二元梯度洗脱，流动相 A为甲醇，流动相 B 为甲醇-水(体积比8∶1);梯度洗脱程序为0～10 min 40%B增加到60%B，10～15 min 60%B，15～18 min 60%B降低到40%B。

1.2.3 结构鉴定

1.2.3.1 红外光谱分析

参照文献[14]方法对按1.2.1方法得到的浓缩液进行分离纯化后，采用傅里叶变换红外光谱进行结构分析。

傅里叶变换红外光谱分析条件:样品经KBr压片，波数范围250～4 000 cm-1。

1.2.3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

将1.2.3.1得到的纯化的L-α-GPE用色谱纯甲醇溶解后进行UPLC-Q-TOF-MS分析。

UPLC条件：ACQUITY UPLC BEH HILIC分析柱(2.1 mm×100 mm，填料粒径1.7 μm)，柱温35℃；流动相A为100%乙腈，流动相B为20 mmol/L醋酸氨，流速0.3 mL/min，等度洗脱。

MS条件：Waters Synapt Q-TOF系统，电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式，离子源温度120℃，毛细管电压3 000 V，锥孔电压30 V，锥孔气流量50 L/h，雾化器温度420℃，雾化气流量500 L/h，质量扫描范围(m/z) 50～1 000。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 pH 对L-α-GPE得率的影响

酶的稳定性是决定反应得率的重要因素，而pH显著影响酶的稳定性，因此不同pH会对酶催化水解反应产生较大影响。在大豆粉末磷脂质量浓度10 mg/mL、反应温度55℃、CaCl2质量浓度3.33 mg/mL(在体系中的终质量浓度，下同)和Rhizopuschinensis浓度63.3 U/mL(在体系中的终浓度，下同)条件下，反应15 h，测定不同pH下L-α-GPE得率，结果见图1。

图1 pH对L-α-GPE得率的影响

由图1 可看出：随着pH的升高，L-α-GPE得率逐渐升高；在pH为7时，L-α-GPE得率最高，这可能与脂肪酶Rhizopuschinensis在此pH下活性最高，其活性部位易与PE结合[15]，易于L-α-GPE的生成有关；继续升高pH，L-α-GPE得率降低。因此，选择最适pH为7。

2.1.2 大豆粉末磷脂质量浓度对L-α-GPE得率的影响

在pH 为7，大豆粉末磷脂质量浓度分别为2.5、3.75、5、7.5、10、15、30 mg/mL，反应温度为55℃，CaCl2质量浓度为3.33 mg/mL和Rhizopuschinensis浓度为63.3 U/mL条件下，反应15 h，测定不同大豆粉末磷脂质量浓度下L-α-GPE得率，结果见图2。

图2 大豆粉末磷脂质量浓度对L-α-GPE得率的影响

由图2 可看出，在大豆粉末磷脂质量浓度低于5 mg/mL时，L-α-GPE得率较高，在大豆粉末磷脂质量浓度高于5 mg/mL时，L-α-GPE得率随大豆粉末磷脂质量浓度增大显著降低。磷脂结构中的亲水基团和疏水基团使其在水中的溶解度很低，只能以胶束形式存在；浓度较低时，磷脂以单分子或小聚集体的形式分散于缓冲溶液中，磷脂液滴的界面面积较大，易与酶结合而被水解；然而，当磷脂浓度超过临界胶束浓度时，磷脂分子逐渐聚集，界面面积减小，磷脂的水解速率降低[16]。图2显示大豆粉末磷脂质量浓度超过5 mg/mL时，L-α-GPE得率出现明显转折，推测该浓度可能接近磷脂的临界浓度，因此选择大豆粉末磷脂质量浓度为5 mg/mL。

2.1.3 反应温度对L-α-GPE得率的影响

在pH为7、大豆粉末磷脂质量浓度为5 mg/mL、CaCl2质量浓度为3.33 mg/mL和Rhizopuschinensis浓度为63.3 U/mL条件下，反应15 h，测定不同反应温度下L-α-GPE得率，结果见图3。

图3 反应温度对L-α-GPE得率的影响

由图3可知，随着反应温度的升高，L-α-GPE得率增加，45℃时L-α-GPE得率达到最大值，继续升高反应温度，L-α-GPE得率反而下降，这可能与温度升高会引起酶构象和稳定性发生变化有关[17]。因此，选择最适反应温度为45℃。

2.1.4 CaCl2质量浓度对L-α-GPE得率的影响

在pH为7、大豆粉末磷脂质量浓度为5 mg/mL、反应温度为45℃、Rhizopuschinensis浓度为63.3 U/mL条件下，反应15 h，测定不同CaCl2质量浓度(0.33、0.67、2.00、3.33、5.33、6.67 mg/mL)下L-α-GPE得率，结果见图4。

图4 CaCl2质量浓度对L-α-GPE得率的影响

脂肪酶Rhizopuschinensis的活性部位通常被包裹在螺旋结构内部，Ca2+能与酶发生配位作用，使酶的C端螺旋结构伸展[18]，从而可以提高脂肪酶Rhizopuschinensis的催化活性，因此CaCl2浓度会对L-α-GPE得率产生一定的影响。

由图4可看出，CaCl2质量浓度由0.33 mg/mL增大到2 mg/mL时，L-α-GPE得率显著增加，继续增加CaCl2的质量浓度，L-α-GPE得率趋于平稳，可能因为CaCl2质量浓度为2 mg/mL时即与酶完全配位，因此选择CaCl2质量浓度为2 mg/mL。

2.1.5 酶浓度对L-α-GPE得率的影响

在pH 为7、大豆粉末磷脂质量浓度为5 mg/mL、反应温度为45℃、CaCl2质量浓度为2 mg/mL条件下，反应15 h，测定不同Rhizopuschinensis浓度下L-α-GPE得率，结果见图5。

图5 酶浓度对L-α-GPE得率的影响

由图5可看出，脂肪酶Rhizopuschinensis在0～30 U/mL浓度范围内，L-α-GPE得率增加，继续增加酶浓度，L-α-GPE得率基本保持不变。酶浓度升高，酶的活性中心增加，底物与活性中心结合的概率增大，酶反应速度越快；但酶的活性中心相对于底物接近饱和时，继续增加酶浓度，产物得率基本不变。因此，选择最适酶浓度为30 U/mL。

2.1.6 最优条件验证

根据单因素实验结果确定了脂肪酶Rhizopuschinensis催化水解大豆粉末磷脂制备L-α-GPE的最佳工艺条件为pH 7、大豆粉末磷脂质量浓度5 mg/mL、反应温度45℃、CaCl2质量浓度2 mg/mL、酶浓度30 U/mL，在此条件进行3次验证实验，L-α-GPE得率分别为94.5%、93.3%和93.7%，平均为93.8%。与脂肪酶Thermo4S-3催化水解大豆粉末磷脂相比[12]，脂肪酶Rhizopuschinensis需要反应更长时间(反应15 h)才能达到与Thermo4S-3(反应6 h)相当的L-α-GPE得率，说明在大豆粉末磷脂水解反应中，脂肪酶Rhizopuschinensis催化活性不如Thermo4S-3高。

2.2 L-α-GPE的纯度

经分离纯化后的L-α-GPE为浅黄色黏稠状液体，经HPLC-ELSD分析，其纯度为99.2%。

2.3 L-α-GPE的结构表征

脂肪酶Rhizopuschinensis催化制备的L-α-GPE的红外光谱及质谱图分别见图6、图7。

图6 L-α-GPE的红外光谱图

图7 L-α-GPE的质谱图

由图7可看出，m/z216和431分别为L-α-GPE的[MH]+和[2m+H]+分子离子峰。

综上，说明产品为L-α-GPE。

3 结 论

通过单因素实验确定了脂肪酶Rhizopuschinensis催化大豆粉末磷脂水解制备L-α-GPE的最佳反应条件为：pH 7，大豆粉末磷脂质量浓度5 mg/mL，CaCl2质量浓度2 mg/mL，酶浓度30 U/mL，反应温度45℃。在最佳条件下反应15 h，制备的L-α-GPE得率为93.8%，经分离纯化产品纯度为99.2%。