甲苯胺蓝快速染色法在乳腺癌及甲状腺乳头状癌冷冻切片诊断中的应用

胡少为，董杏梅，李楚天

甲苯胺蓝(toluidine blue, TB)是一种在结构上与亚甲蓝和苯胺蓝A相似的嗜酸性噻嗪类碱性染料，溶于水和乙醇，与细胞中DNA和RNA的酸性基团(包括羧酸、硫酸、磷酸盐等基团)有着较强的亲和性，是一种人工合成的核酸染色剂。肿瘤细胞的DNA、RNA合成量显著增多，因此TB在肿瘤细胞更易着色，且着色时间久，其着色程度也可反映细胞内DNA和RNA的含量[1]。目前TB染色已被广泛应用于子宫颈、口腔、咽喉、食管、胃肠等部位恶性肿瘤的活体检查，及肥大细胞[2]和幽门螺杆菌[3]的特殊染色中。本科室在冷冻切片染色的探索实践中发现TB可以用于术中诊断乳腺癌及甲状腺乳头状癌的冷冻切片染色，其细胞染色对比鲜明，能清晰的显示组织的结构和细胞形态，同时操作步骤更简单、快速，且经济实用。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019～2021年广州中医药大学第二附属医院/广东省中医院病理科存档的40例乳腺癌和30例甲状腺乳头状癌。乳腺癌患者均为女性，年龄33～65岁，均为乳腺浸润性癌(非特殊类型)。甲状腺乳头状癌中，男性8例，女性22例，年龄22～60岁。

1.2 主要试剂及配制将0.5 g TB完全溶解于100 mL蒸馏水中，配成0.5 g/dL TB溶液。

1.3 方法将6 μm厚新鲜标本冷冻切片吸附于载玻片上，快速放入甲醇溶液内上下振动3～5次，取出玻片，在装有流水的器皿内快速振动3～5次，再放入0.5 g/dL TB溶液中染色10～20 s，取出玻片，于装有流水的器皿内快速振动2～3次，盖玻片封片，用滤纸吸掉多余的水。

用于保存的冷冻切片需用丙三醇封片保存，再次阅片时可揭下盖玻片，流水冲洗，放入TB溶液中重染10～20 s，在装有流水的器皿内快速振动2～3次，盖玻片封片即可。

2 结果

镜下见不同细胞经TB染色呈不同强度的蓝色，因此可以较好地辨别不同组织的结构和细胞形态。正常乳腺整个导管-小叶系统被覆的细胞为双层结构，即内层(腺腔面)上皮细胞层和外层(基底面)肌上皮细胞层，导管上皮细胞呈立方状或柱状，外层围绕的肌上皮细胞胞核梭形或短梭形。导管原位癌及导管上皮不典型增生TB染色示腺腔内上皮细胞呈浅蓝色，胞质丰富，细胞核体积增大、染色质淡染，可见核分裂象，导管周围肌上皮细胞胞核呈深蓝色。浸润性癌细胞呈腺管、片状或条索状生长，细胞核体积增大、淡染，周围未见深染的肌上皮细胞。在本组40例乳腺癌组织冷冻切片上，TB染色显示的正常导管上皮细胞、肌上皮细胞、导管原位癌细胞及浸润性癌细胞染色强度对比鲜明，结果稳定(图1、2)。

甲状腺乳头状癌组织冷冻切片经TB染色可以清晰地显示甲状腺乳头状癌的乳头呈分枝状，具有纤细的血管轴心，被覆单层或复层立方细胞，细胞排列拥挤、重叠，细胞核增大，细胞核毛玻璃样，核膜增厚，核仁不明显，细胞核内易见深核沟及核内假包涵体，局灶可见钙化(图3～5)，并与周围正常甲状腺滤泡上皮细胞形态形成鲜明对比。周围正常甲状腺由大小不一的圆形或卵圆形滤泡构成，滤泡内衬单层滤泡上皮细胞，细胞呈扁平或矮柱状，滤泡上皮细胞核深染，染色质浓缩。

3 讨论

TB是一种常用的醌亚胺类碱性染料，包含胺基、醌型苯环2个发色团与2个助色团，助色团促使染料电离成阳离子盐类，阳离子帮助发色团对组织及其他被染物细胞中的酸性物质产生亲和力，使切片上的组织及细胞核染成蓝色[4]。

目前，TB染色已被广泛应用于口腔癌前病变或口腔鳞状细胞癌[5]，头颈部、食管、外阴、女性生殖系统的子宫内膜复杂性增生伴不典型性、子宫内膜癌及其癌前病变[6]、阴道细胞学检测及胃癌及胃癌癌前病变[7]的上消化道恶性肿瘤等的研究中，还用于生殖道感染的病原菌、胃黏膜活检组织切片幽门螺杆菌(HP)，组织中的组织细胞、肥大细胞、血管、红细胞和胶原纤维的染色。因其经济、简单、快速、准确度高的特点，已受国内外专家的关注，并被广泛应用于许多临床工作中。

本实验发现TB染色在冷冻切片诊断乳腺癌及甲状腺乳头状癌中也有很多优点。正常乳腺整个导管-小叶系统由上皮细胞层和肌上皮细胞层组成，这种双层结构对乳腺病理诊断极其重要，它是区分良、恶性病变的主要指标之一。由于肌上皮细胞经TB染色呈深蓝色，在冷冻切片上易见，且与导管上皮染色对比鲜明，这样能较好地明确增生的导管上皮周围有无肌上皮细胞，对乳腺浸润性癌的诊断提供明确的诊断依据。因此，导管原位癌病变时，导管上皮呈实体型、筛状或粉刺状等不同的形态生长，经TB染色异型的导管上皮细胞核淡染，周围肌上皮细胞核深染。浸润性癌细胞胞核淡染，周边缺失深染的肌上皮细胞。而且，TB染色能够较好地显示细胞核的染色质情况，乳腺癌细胞核淡染、颗粒状，与正常导管上皮细胞的染色明显不同，正常导管上皮细胞核染色相对较深，染色质细腻。

在甲状腺乳头状癌组织冷冻切片中，TB染色可更清晰地显示出甲状腺乳头状癌组织学及细胞核特征，这些特征是诊断甲状腺乳头状癌的必要条件。

在技术操作上，TB染色较传统染色也有很多优点，且值得提倡和推广。TB染色突出的优点有：(1)染色快速，仅需50～60 s，操作简便，显著缩短冷冻切片染色时间；(2)经济、实用，仅需0.5 g/dL TB，节约成本，易推广，具有一定的临床应用价值；(3)染色效果好且稳定，能清楚地辨别乳腺导管上皮细胞、肌上皮细胞，尤其是明确浸润情况及甲状腺乳头状癌细胞核的典型特征，显著提高冷冻病理诊断准确率；(4)甘油封片易于冷冻切片保存，可有效防治干片。

TB染色方法简便、快速，可作为术中诊断乳腺癌及甲状腺乳头状癌的常用辅助染色方法，可提高术中冷冻切片病理诊断的的精准度，有一定的实用价值。