坚果与籽类食品中黄曲霉毒素B1的检测

赵飞

辽宁省检验检测认证中心（沈阳 110000）

GB 19300—2014《食品安全国家标准 坚果与籽类食品》中对坚果与籽类食品定义为以坚果、籽类或其籽仁为主要原料，经加工制成的食品，如板栗、杏核、开心果、松籽等。坚果与籽类食品口味独特，营养丰富，且富含多种营养素[1]。随着生活水平的提高，坚果与籽类食品得到消费者的关注和喜爱，该类食品的年消费量也随之增高[2]。欧盟食品和饲料快速警报系统报告显示，真菌毒素是坚果与籽类食品中报告频率最高的有害物质[3-4]。根据2020年辽宁省食品安全抽检信息公布结果，有一批油炸花生米检出黄曲霉毒素B1超限量[5]。已发现的黄曲霉毒素有20余种，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强[6-7]。黄曲霉毒素B1的提取主要是采用合适的有机溶剂或有机溶液[8]，对于部分样品，也可向提取溶剂或溶液中加入适量有机酸，更好地保持稳定的酸碱度。黄曲霉毒素B1检测的净化方法主要有稀释法[9-10]、分子印迹技术[11]、免疫亲和柱[12]、固相萃取柱[13]和QuEChERS[14-15]等。食品中黄曲霉毒素B1的检测方法主要有高效液相色谱法[16-17]、液相色谱-质谱法[18-20]、荧光探针法[21]和酶联免疫吸附法[22-23]等。其中，液相色谱-质谱法具有分析结果准确、灵敏度高、分离度好、分析速度快、操作简便、省时的优势等，该检测技术结合快速样品前处理方法，具有高灵敏度和优异的选择性[10]。微波萃取是一种高效的样品前处理方法[24]。该技术被广泛应用于多环芳烃、有机磷农药等检测[24-26]，一定程度解决有机溶剂用量大、检测成本高等问题。试验将微波萃取与液相色谱-质谱法相结合，用于坚果与籽类食品中黄曲霉毒素B1的测定，为坚果与籽类食品中黄曲霉毒素B1的快速筛查与检测提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；试验用水为Mili Q超纯水。

标准品：黄曲霉毒素B1（质量浓度25.0 μg/mL，青岛普瑞邦生物工程有限公司）。

1.2 仪器与设备

A10 Milli Q超纯水机（美国Millipore公司）；岛津8050超高效液相色谱串联质谱仪（日本岛津公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品溶液制备

取一定量且具有代表性的坚果与籽类食品，经粉碎机粉碎并混合均匀。称取5 g（精确至0.01 g）上述样品于微波消解罐中，准确加入10 mL甲醇，涡旋30 s使样品与甲醇充分接触，后将其置于微波消解仪中进行微波萃取，萃取条件：0～3 min，20～80 ℃；3～8 min，80 ℃保持。待萃取完成，冷却至室温，慢慢旋开微波消解罐盖子，将提取液转移至10 mL容量瓶中，并用甲醇清洗剩余残渣，清洗液合并至容量瓶中，最后用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，滤液置于进样小瓶中待测。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为水，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序：0～0.5 min，90% A；0.5～1.5 min，90% A～70% A；1.5～2.0 min，30% A～30% A；2.0～2.5 min，30% A～60% A；2.5～3.0 min，60% A～60% A；3.0～3.5 min，60% A～90% A。流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样体积5 μL。

1.3.3 质谱条件

离子化方式ESI；扫描方式为正离子；检测方式为多反应离子监测；接口温度300 ℃；喷雾电压2.5 kV；干燥气流量10 L/min；雾化气流量3 L/min；定量离子对313.2/285.1；定性离子对313.2/241.2；Q1 Pre偏差-25 V；Q3 Pre偏差-29 V；碰撞能量-25 V。

2 结果与分析

2.1 萃取条件的优化

以不含黄曲霉毒素B1的花生为样品，分别平行称量5.00 g经充分的粉碎混匀的样品进行加标试验，加标量0.6 μg/kg。加标后的样品均放置过夜，使黄曲霉毒素B1充分渗透到花生基质中，以此探索优化提取条件。

2.1.1 萃取溶剂的选择

分别选取甲醇、乙腈、乙酸乙酯和30%甲醇溶液作为微波萃取剂，采用相同的微波萃取程序对加标回收试验样品进行微波萃取，并采用优化的色谱条件和质谱条件对提取溶液进行检测。结果显示，相同条件下，当以甲醇作为微波萃取剂时，萃取回收率和精密度最好，因此研究中最终选择以甲醇作为微波萃取剂。

2.1.2 萃取温度的优化

以甲醇作为微波萃取剂，萃取最高温度分别设置为60，70，80和90 ℃，其他条件相同，对加标回收试验样品进行微波萃取，并采用优化的色谱条件和质谱条件对提取溶液进行检测。结果显示，当萃取最高温度设置为80 ℃时，萃取回收率和精密度均较好，因此本研究中以甲醇作为微波萃取剂，萃取最高温度设置为80 ℃。

2.1.3 萃取时间的优化

以甲醇作为微波萃取剂，萃取最高温度设置为80 ℃，将微波萃取程序中温度由室温上升至80 ℃时间分别设置为2，3，4和5 min，80 ℃时保持时间均为3 min，经微波萃取检测，结果显示，当萃取温度由室温上升至80 ℃时，经过3，4和5 min回收率无明显差异，因此爬升时间设置为3 min。将萃取温度由室温上升至80 ℃时间设置为3 min，将80 ℃时保持时间分别设置为3，5，7和10 min，再进行微波萃取和检测，通过检测计算得到保持时间5 min时，回收率最高，因此选择保持时间为5 min。

2.2 质谱条件的优化

参考GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》第一法中黄曲霉毒素B1的条件，在正离子模式下，以质量浓度300 ng/mL的标准溶液作为测试液，依次对喷雾电压、母离子、Q1 Pre偏差、子离子、碰撞能量、Q3 Pre偏差等质谱参数进行优化，优化的参数见1.3.3质谱条件。

2.3 色谱条件的优化

以5 ng/mL黄曲霉毒素B1标准溶液为测试液，采用Acquity BEH C18色谱柱进行分离分析，建立流动相梯度程序。并采用建立的色谱分离条件，对回收试验溶液进行检测，在黄曲霉毒素B1出峰时间无色谱干扰，优化后的黄曲霉毒素B1标准溶液的谱图见图1。

图1 黄曲霉毒素B1标准溶液谱图

2.4 基质效应的考察

为保证试验所建立的方法准确性，对基质效应进行考察。分别配制溶剂标准曲线、基质标准曲线。以2条曲线的斜率比值来评价基质效应情况。结果表明，溶剂标准曲线与基质标准曲线的斜率比值小于0.8，说明采用该方法检测坚果与籽类食品时，基质中的成分对待测样品中黄曲霉毒素B1的质谱响应具有明显的抑制作用。制作基质工作曲线，通过比较基质工作曲线和基质标准曲线的斜率，两者无明显差别。鉴于上述获得的情况，为保证检测结果的准确可靠，采用基质标准曲线对待测样品进行定量。

2.5 方法学验证

在优化的最佳萃取条件和检测条件下，以空白坚果与籽类样品提取液配制基质标准曲线；向空白样品中分别添加3个浓度水平的黄曲霉毒素B1的标准溶液，并平行进行3次试验，其余步骤同样品溶液制备。黄曲霉毒素B1在0.25～10 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.999 4；以3倍噪声的添加浓度为方法检出限，方法的黄曲霉毒素B1检出限为0.1 μg/kg；回收率为88.0%～101.2%，相对标准偏差为1.3%～ 4.1%，说明试验方法有较好的准确度和精密度，回收率和精密度的具体数据见表1。

表1 回收率和精密度试验结果表

2.6 样品测定

采用试验建立的微波萃取-超高效液相色谱-串联质谱联用法，对市售的坚果与籽类食品进行提取和检测，共开展30批次的坚果与籽类食品的分析测试，在核桃和花生中检出黄曲霉毒素B1，各1批次，但检测结果均满足GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》的规定。

3 结论

将微波萃取技术与超高效液相色谱-串联质谱法相结合，通过对色谱条件、质谱条件，萃取条件进行优化，对基质效应进行考察，得到并建立用于坚果与籽类食品中黄曲霉毒素B1的检测方法。该方法以高灵敏度、高选择性、快速高效、操作简便、试验成本低为主要特点，适用于坚果与籽类食品中黄曲霉毒素B1的快速定性筛查和定量检测，为坚果与籽类食品中真菌毒素的检测提供新方法。