辣木籽总黄酮提取工艺

侯真真，谢晓帆，李瑞婷

广州工商学院（广州 510850）

辣木为多年生热带落叶乔木，原产于热带和亚热带地区，在我国云南、广西等地区已有种植，因其根具有辛辣味而得名。辣木籽是辣木的种子，是径约8 mm的椭圆性球状物体，去壳呈白色，可直接食用，富含脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、黄酮及多酚等化合物，具有降血压、抗氧化、抗癌等多种生物活性功能，是一种新资源食品，具有一定的研究价值。由于辣木独特的抗菌及絮凝属性，辣木籽也被广泛应用于水质净化处理。此外，辣木籽是化妆美容产品、新能源柴油的潜在优质原料之一[1]。

黄酮类化合物，又称黄酮体、黄碱素，对防治肝病，防癌抗癌，抑制肥胖，预防基因突变，治疗冠心病、心绞痛、高血压，活血化癖也起重要药理活性作用[2]。辣木籽中的黄酮类化合物丰富，主要以结合形式存在，具有抗肿瘤、降血糖、护肝杀虫、减肥降脂、活血化瘀等作用[3]。近年来，辣木籽被指定为国家新资源食品开发的原材料，具有较大开发潜力和前景。因此，研究辣木籽中黄酮类化合物的提取工艺具有重要的意义。研究采用超声波辅助提取辣木籽中黄酮类化合物，并进行工艺优化，以期为辣木籽的进一步开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣木籽，市售；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；芦丁标准品（西安汇林生物科技有限公司）；六水合三氯化铝（分析纯，西陇科学化工）。

1.2 仪器与设备

MS204S电子天平（右一仪器有限公司）；UV-2450数显紫外分光光度计（连华科技有限公司）；DL-5-B台式高速离心机（安亭科学仪器厂）；BDA-1002超声震荡器（微米派科技有限公司）。

1.3 工艺流程

原生态辣木籽→去壳→干燥（60 ℃热风烘干）→粉碎过筛（0.250 mm筛）→称取2 g干粉→加入一定量乙醇→超声波辅助提取→水浴→离心机过滤→取上清液→加入三氯化铝显色→定容→测定总黄酮含量

1.4 试验方法

1.4.1 样品的制备

辣木籽总黄酮粗品制备：在60 ℃鼓风箱烘干一定时间至恒重，粉碎过0.180 mm分子筛，制得辣木籽粉末，将粉末置于干燥器中备用[4]。

1.4.2 芦丁标准曲线的绘制

取芦丁标准品烘干28 h至恒重，待用。将0.022 1 g芦丁标准品放入50 mL容量瓶中，用40%的乙醇配制0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。吸取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10 mL芦丁标准溶液加入25 mL容量瓶中，加入2.5 mL 2%三氯化铝，再用40%的乙醇进行定容，摇匀，静置25 min。测定提取液在400 nm波长处的吸光度，记录结果并绘制标曲。求得回归曲线方程：A=0.265 1C+0.002 6（0.993 8）。其中，芦丁标准液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标。

1.4.3 试验步骤

取2 g烘干至恒重的辣木籽粉末，加入体积分数为40%的乙醇，再经过不同的超声波时间、水浴锅温度、提取次数、乙醇体积分数、料液比的条件处理，静置15 min使其冷却，取上层清液（使用4 000 r/min离心20 min），提取一定量待测溶液进行显色反应。

其中，单因素设定：超声波提取时间为20，30，40，50和60 min；料液比为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）；水浴锅温度为30，40，50，60和70 ℃；乙醇体积分数为40%，50%，60%，70%和80%；离心提取次数为1，2，3，4和5次。按照设定条件分别进行试验，提取最适宜条件，再通过3次平行试验进行验证。

1.4.4 响应面优化试验

运用Design-Expert 8.0.6.1软件，将单因素试验的最优结果与Box-Behnken中心组合试验相结合，分别选取料液比（A）、乙醇体积分数（B）以及超声时间（C）3个自变量，以辣木籽中总黄酮得率为响应值进行响应面优化试验，因素与水平见表1。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声提取时间对辣木籽总黄酮提取率的影响

采用超声波辅助水浴法，以40%乙醇为提取溶剂，在水浴锅温度50 ℃，料液比1∶10（g/mL）的固定条件下，超声提取时间分别设置为20，30，40，50和60 min，不同超声提取时间对黄酮提取率的影响如图1所示。

图1 超声提取时间变化对辣木籽黄酮提取率的影响

由图1可知，超声提取时间以50 min为分界点，起初辣木籽黄酮得率不断上升，在超过50 min时，趋势才呈现下降。这种情况是因为当超声时间过短时，辣木籽中的黄酮类物质溶解较少，析出率低；但随着时间的增加，超声波的空化作用及机械振动作用导致细胞膜破裂，因此提取率上升[4]。但当超声时间超过50 min时可能导致辣木籽细胞内其他物质析出，影响总黄酮的纯度。同时，长时间的提取也会导致少量乙醇挥发，从而降低总黄酮的得率。综上所述，超声提取时间为50 min时提取效果最好。

2.1.2 料液比对辣木籽总黄酮提取率的影响

采用超声波辅助水浴法，以40%乙醇为提取溶剂，在超声波时间为30 min，提取温度为50 ℃的固定条件下，料液比分别设置为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL），不同料液比对黄酮提取率的影响如图2所示。

图2 料液比变化对辣木籽黄酮提取率的影响

随着乙醇用量的不断增多，乙醇充分溶解了辣木籽中的黄酮类物质，最佳溶解状态是料液比1∶10（g/mL）。之后再不断增加液料比，辣木籽中黄酮类物质的得率反而出现波动式下降趋势，可能是固液比的增多使黄酮类物质充分溶解的同时，还会导致一些其他杂质成分析出，影响黄酮物质的纯度，从而使总黄酮提取率降低，因此最佳料液比为1∶10（g/mL）。

2.1.3 提取温度对辣木籽总黄酮提取率的影响

采用超声波辅助水浴法，以40%乙醇为提取剂，在料液比1∶10（g/mL），超声时间30 min的条件下，提取温度分别设置为30，40，50，60和70 ℃，提取温度的变化对黄酮提取率的影响如图3所示。

图3 提取温度变化对辣木籽黄酮提取率的影响

由图3可知，在初始阶段，温度过低不利于辣木籽内部物质的析出，提取率不高。随着温度的升高，溶剂分子运动加剧，黄酮提取率也不断升高，在50 ℃时达到最大值，这是由于黄酮类化合物在乙醇中的溶解度随温度的升高而增加，随着温度升高，扩散系数增大，提取剂的渗透能力也相应增强，使有效成分浸出速率增大[5]。此时辣木籽物料内部得到充分沸腾，强化了传质过程，使提取效果达到最佳。温度超过50 ℃时，提取率开始下降，这是由于乙醇的沸点是78 ℃，当温度不断升高接近至沸点时，乙醇挥发影响黄酮的提取。综合考虑，选取50 ℃为最佳提取温度。2.1.4 乙醇体积分数对辣木籽总黄酮提取率的影响

采用超声波辅助水浴法，在超声时间30 min，料液比1∶10（g/mL），提取温度50 ℃的条件下，乙醇体积分数分别设置为40%，50%，60%，70%和80%，乙醇体积分数的变化对辣木籽中的总黄酮提取率的影响如4所示。

由图4可知，乙醇体积分数在40%～70%的范围内时，辣木籽总黄酮的提取率与乙醇体积分数呈正比，在体积分数为70%时提取率最高，超过70%之后，提取率随体积分数上升而下降，可能是乙醇体积分数升高导致少量醇溶性物质析出，从而影响辣木籽中黄酮物质的溶解度[6]。因此，选取体积分数70%乙醇为提取剂。

图4 乙醇体积分数变化对辣木籽黄酮提取率的影响

2.1.5 离心次数对辣木籽总黄酮提取率的影响

采用超声波辅助水浴法，以40%乙醇为提取溶剂，在料液比1∶10（g/mL），超声时间30 min，提取温度50 ℃的条件下，离心次数分别设置为1，2，3，4和5次，不同离心次数对辣木籽中的总黄酮提取率的影响如图5所示。

图5 提取次数变化对辣木籽黄酮提取率的影响

从图5可以看出，离心次数对黄酮提取率有一定影响，随着离心次数的增加，黄酮物质析出率也不断增加，在第5次时取到最大值[7-8]。可能是因为相对一定量的提取溶剂，其所能溶解的黄酮类化合物的量是相对应的，但随着离心次数的增加，得到的上清液杂质较少，检测到的黄酮物质也随之增多。

2.2 响应面优化辣木籽总黄酮提取条件

2.2.1 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，设置料液比、乙醇体积分数、超声时间3个因素进行响应面设计，具体结果见表2。

表2 响应面试验方案及结果

2.2.2 回归方程建立及模型方差分析

运用Design-Expert 8.0.6.1软件，对表2进行拟合后，得到总黄酮含量（Y）的二次回归方程：Y=8.64-0.99A+3.37B+0.86C-0.91AB+1.80AC+0.63BC-1.45A2- 2.57 B2-1.32 C2，检验结果见表3。

表3 响应面试验方差分析及显著性检验

由表3可知，失拟=0.381 4（P＞0.05）不显著，说明该模型具有较高拟合度和可信度，使用该方程进行试验分析是可行的。F=43.73，P＜0.01，由此可得该模型极为显著。料液比与乙醇体积分数交互为0.028 3（P＜0.05），差异高度显著；料液比与超声时间交互为0.000 9（P＜0.01），差异极显著；乙醇体积分数与超声时间交互为0.095 9（P＜0.05），差异显著。采用Design-Expert 8.0.6软件建立模型，并将表3中具体数据转化为3D曲面图（详见图6～图8）。由表2和表3可知，影响辣木籽中总黄酮得率由高到低的顺序为乙醇体积分数（B）＞料液比（A）＞超声时间（C）。

图6 料液比与超声时间的响应面3D模型图

图7 乙醇体积分数与料液比的响应面3D模型图

图8 乙醇体积分数与超声时间的响应面3D模型图

2.2.3 响应面法的可靠性验证

采用Design-Expert 8.0.6软件建立模型，通过响应面分析并优化，预测的总黄酮提取率为8.481%，将模型预测的条件取整数：乙醇体积分数76%，料液液比为1∶15（g/mL），超声波时间为60 min。并对最佳工艺条件进行验证试验，得到的辣木籽总类黄酮提取率为8.361%±0.015%，与预测值基本一致，由此可得，该响应面法优化超声波辅助水浴提取辣木籽总黄酮的工艺较具有一定可行性。

3 结论

试验运用响应面法优化超声波辅助水浴法对提取辣木籽总黄酮的工艺优化进行探讨。在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，结果表明，料液比、超声波提取时间、乙醇体积分数对黄酮类化合物提取率的影响最为显著，且由强到弱依次为乙醇体积分数＞料液比＞超声波时间。结果表明，以体积分数76.04%的无水乙醇为提取溶液，固液比为1∶15（g/mL），超声波提取时间为60 min时，辣木籽中的黄酮化合物得率达到最高。在上述条件下，辣木籽总类黄酮提取率可达到8.361%±0.015%，理论值为8.481%，结果与预测值基本一致，证明了模型的有效性，工艺稳定可行。