小檗碱通过抑制内质网应激反应发挥对糖尿病肾病大鼠的保护作用

王妍菲，杨慧娟，李杭霖，赵雯雯，王梦慈，费成璆，张继强

（蚌埠医学院第一附属医院肾病科，安徽 蚌埠 233099）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是最严重的糖尿病微血管并发症之一，也是全球终末期肾脏病的主要病因［1］，其发病率高，危害性大，在全球范围内造成了沉重的医疗负担。截至目前，针对DN 的防治手段仍旧停留在调节饮食，控制血糖，降低血压及抑制肾素-醛固酮系统（RAS）的激活上，大多数DN 患者难逃终身透析的命运［2］。DN 发病原因多样，发病机制复杂且尚未明确，针对性治疗手段缺乏，故探索DN 发病机制，研发新的治疗药物尤其重要。

小檗碱（又名黄连素）是从中草药黄连中提取分离得到的一种具有抗菌作用的异喹啉生物碱，在降糖、调脂、改善胰岛抵抗、增加胰岛素敏感性、抗击氧化损伤等方面具有良好生物效应［3］，在治疗糖尿病及糖尿病并发症上的应用机制尚未被完全阐明。研究报道，过度激活的内质网应激反应（ERS）可以启动细胞凋亡信号途径，参与多种类型肾脏细胞损伤的过程。研究表明小檗碱可通过抑制过度激活的内质网应激来减轻ERS 启动的细胞凋亡信号途径，从而发挥对神经［4］、心血管［5-7］、胃肠道［8］等的保护作用。本研究以小檗碱在DN 中的作用及机制为研究目标，明确小檗碱是否能通过影响DN ERS 来减轻肾脏组织损伤，为小檗碱的临床应用提供科学依据，并为早期DN 防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD 大鼠（8 周，180～200 g，购于蚌埠医学院动物实验中心）。

1.2 实验试剂及主要仪器

盐酸小檗碱（纯度≥97%，B832574，合肥睿捷生物科技有限公司）；链脲佐菌素（STZ，纯度≥98%，S8050，购于北京索莱宝公司）；尿蛋白定量试剂盒（C035-2-1，南京建成生物工程研究所）；兔抗大鼠转录因子6（DF6009）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）（DF6025）、肌醇需求酶1（IRE1）（DF7709）、蛋白激酶R 样内质网应激酶（PERK）（AF5304）、半 胱 天 冬 酶3（Caspase3）（AF6311）、Nephrin（DF7501），上述抗体均购于Affinity；通用型二抗试剂盒（Zsbio）；DAB 显色试剂盒（Zsbio）。

1.3 实验分组及干预

24 只大鼠普通饲料适应性喂养1 周后，随机取6 只做正常组（NC 组），予普通饲料喂养。余18 只予高糖高脂饲料（配方参考：10%猪油，20%白糖，2.5%胆固醇，0.5%胆酸钠，67%基础饲料）喂养4周后联合腹腔注射STZ 45 mg/kg［9］进行糖尿病大鼠造模，3 d 后尾静脉采血测随机血糖≥16.8 mmoL/L 的为糖尿病大鼠造模成功（本实验造模18只，成功16 只，成模率88.9%）。造模成功的16 只大鼠，继续高糖高脂饲料喂养，2 周后测尿蛋白≥30 mg/24 h 为DN 大鼠造模成功。选取成模状态良好的12 只，随机分为模型组（DN 组）和小檗碱干预组（DN+BBR 组）（n=6）。其中DN+BBR 组予BBR 200 mg·kg-1·d-1［9］灌 胃 治 疗，NC 组 及DN 组 予 以 同计量的羧甲基纤维素钠，灌胃6 周。干预期间，每周称重大鼠并记录数据，NC 组予普通饲料喂养，DN组及DN+BBR 组予高糖高脂饲料喂养。密切关注大鼠饮食水、精神及活动状态、毛发色泽等情况。实验室采取12 h 明暗交替，模拟日光照射。

1.4 生化指标检测

最后一次灌胃干预后，称量大鼠体重并记录数据。禁食不禁水，代谢笼收集大鼠24 h 尿液，根据尿蛋白定量试剂盒（CBB 法）检测并按公式计算各大鼠24 h 尿蛋白（24 h Upro）。腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉大鼠并将其固定于手术台，腹主动脉采血，全自动生化分析仪分析并记录各组大鼠空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）等。

1.5 组织染色

留取大鼠双侧肾脏组织，去除表面包膜，取部分肾脏组织，用2.5% 戊二醛固定，备用于透射电子显微镜检测。其余肾脏组织采用4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，而后依次将各切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、75%酒精各5 min，流水缓慢冲洗几遍，脱蜡至水。进行HE、PAS、Masson 染色，光镜下观察各大鼠肾组织病理改变，采集图像并进行分析。

1.6 透射电子显微镜

新鲜组织快速取样2～3 mm2，PBS 漂洗表面血迹污渍，投入2.5%戊二醛（电镜专用固定液）中，室温固定2 h 后转至4 ℃保存。0.1 mol/L 磷酸缓冲液PB（pH7.4）配制1%锇酸进行后固定（室温避光1～2 h）。 梯度脱水处理。乙酸异戊酯置换100%乙醇，提高干燥效率。 临界点干燥仪干燥样本。离子溅射仪样品台上喷金镀膜，显微镜下采集图像并进行分析。

1.7 免疫组织化学染色

依次过3 道二甲苯，3 道乙醇，切片冲洗干净透明后，进行抗原高压修复，免疫组化笔圈定组织并滴加3% H2O2，室温孵育20 min，37℃，孵育一抗1 h（CHOP：1：100、PERK：1：100、IRE1：1：300、ATF6：1：100、Nephrin：1：200、Caspase-3：1：100），37 ℃孵育二抗20 min，DAB 显色，衬染，分化，水洗，蓝化，脱水、透明、封片。显微镜下采集图像并进行分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小檗碱对DN 大鼠一般状况及肾功能的影响

与NC 组相比，DN 组大鼠精神倦怠，活动度低，毛发黯淡无光，体重不增甚或减轻，饮食水量明显增加，尿量增加，偶有稀便，血清及尿液生化检测显示Scr、BUN、24 h Upro 显著升高（P＜0.05），大鼠肾指数KI 明显增高（P＜0.05），差异具有统计学意义；与DN 组相比，经小檗碱干预后，DN+BBR 组大鼠精神状态好转，活动度增加，毛发色泽如常，体重较前者有所改善。见表1。

表1 各组大鼠生化指标结果对比（n=6，±s）Tab 1 Comparison of biochemical index of all rat groups（n=6，±s）

表1 各组大鼠生化指标结果对比（n=6，±s）Tab 1 Comparison of biochemical index of all rat groups（n=6，±s）

注：与NC 组比,*P＜0.05；与DN 组比,#P＜0.05。

BUN(mmol/L)8.77±0.61 13.47±2.19*6.16±2.41#22.509 0.000组别GLU(mmol/L)KI(‰)Scr（μmol/L)NC 组DN 组DN+BBR 组F P 9.87±1.12 26.84±3.57*14.45±3.01#60.114 0.000 8.08±0.31 11.37±1.18*8.93±1.37#15.543 0.000 24 h Upro(mg/24 h)3.13±0.31 39.71±3.35*6.71±0.74#615.949 0.000 25.17±1.17 43.17±3.54*30.83±2.93#67.763 0.000

2.2 小檗碱对DN 大鼠肾脏组织病理形态的影响

HE 染色及PAS 染色显示，DN 组肾小球形态不规则，体积增大，肾小球囊腔缩窄，弥漫性系膜基质增多，基底膜不均匀增厚，肾小管水肿，肾间质紫红色糖原沉积物增多，炎性细胞浸润。经小檗碱干预处理后，DN+BBR 组肾小球状况明显改善，肾小管水肿减轻，糖原沉积减少（图1A、B）。Masson 染色显示，DN 组蓝染的胶原纤维堆积，NC 组及DN+BBR 组胶原纤维堆积相对较少，三者基底膜增厚均不明显（图1C）。

图1 各组大鼠病理组织染色结果（×400）Fig 1 Staining results of pathological tissue in all rat groups（×400）

2.3 小檗碱对DN 大鼠肾脏超微结构的影响

与NC 组相比，DN 组足突细胞不规则排列合并融合、断裂，基底膜不均匀增厚，经小檗碱干预处理后，DN+BBR 组足突断裂改善，基底膜增厚减轻。见图2。

图2 各组大鼠透射电子显微镜结果Fig 2 Transmission electron microscopy results of all rat groups

2.4 小檗碱对DN 大鼠ERS 相关蛋白表达的影响

与NC 组相比，DN 组ERS 相关蛋白即UPR 三条主通路蛋白PERK、ATF6、IRE1 及共同下游因子CHOP 的表达量在肾脏组织中弥漫性增加，ERS 凋亡相关蛋白Caspase3 表达量也有所升高；经小檗碱干预治疗后，相关蛋白表达量均显著下降（P＜0.05），差异具有统计学意义。见表2 及图3。

图3 各组大鼠免疫组织化学染色结果（×400）Fig 3 Immunohistochemical staining results of all rat groups（×400）

表2 各组大鼠免疫组织化学染色光密度值结果对比（n=6，±s）Tab 2 Comparison of immunohistochemical staining optical density values of rats in each group（n=6，±s）

表2 各组大鼠免疫组织化学染色光密度值结果对比（n=6，±s）Tab 2 Comparison of immunohistochemical staining optical density values of rats in each group（n=6，±s）

注：与NC 组比,*P＜0.05；与DN 组比,#P＜0.05。

Caspase3 0.17±0.01 0.34±0.01*0.27±0.02#292.060 0.000组别NC 组DN 组DN+BBR 组FP ATF6 0.24±0.01 0.34±0.01*0.28±0.01#100.392 0.000 PERK 0.15±0.01 0.30±0.01*0.24±0.01#344.165 0.000 IRE1 0.22±0.01 0.37±0.01*0.28±0.01#307.074 0.000 CHOP 0.16±0.01 0.35±0.01*0.27±0.01#451.950 0.000

3 讨论

DN 是目前最普遍的慢性肾脏疾病，也是成人终末期肾脏疾病的主要原因，占需要肾脏替代治疗患者的40%［10，11］。持续性蛋白尿和（或）肾小球滤过功能减退是DN 的主要临床特征。本实验以大鼠尾静脉血糖≥16.8 mmoL/L +24 h 尿蛋白定量≥30 mg 为DN 造模成功指标，实验结束后，组织病理结果显示DN 组大鼠肾小球形态不规则，体积增大，肾小球囊腔缩窄，弥漫性系膜基质增多，基底膜不均匀增厚，肾小管水肿，肾间质紫红色糖原沉积物增多，炎性细胞浸润。透射电子显微镜可观察到DN 组足细胞排列紊乱，断裂、融合严重，基底膜不均匀增厚，符合糖尿病肾病病理表现。

DN 发病机制复杂，现代医学研究表明肾小球高血压、肾血流动力学改变、缺血和缺氧、氧化应激以及RAS 上调在DN 的发病中扮演着重要的角色［12］。近期研究表明，内质网在维持肾脏组织蛋白质的稳态中发挥着重要作用。长时期的糖代谢紊乱可刺激内质网发生应激反应，引发肾脏固有细胞如肾小管细胞、肾小球内皮细胞、肾小球系膜细胞及系膜基质、足细胞等损伤甚至凋亡，损害肾脏组织。ERS 已成为DN 发病机制的研究热点。本研究以ERS 为切入点，探讨ERS 是否参与糖尿病肾病的发病，为DN 提供新的治疗思路。

内质网是真核生物重要的细胞器，参与蛋白质的折叠，加工和运输，并在炎症调节及细胞凋亡方面发挥重要作用［13，14］。各种病理、生理因素均可使内质网腔内环境产生异常，导致蛋白质异常折叠或错误折叠，从而激发ERS［15］。ERS 或未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）可通过发挥减少异常蛋白质的聚集、增加错误蛋白质的降解等作用，减轻内质网压力，维持内质网稳态。当外界刺激持续时间久、刺激强度过高时，ERS 过度激活，稳态 失 衡，UPR 则 通 过 激 活ATF6、IRE1、PERK3 条路径启动细胞内凋亡信号。本实验研究，在高糖、高脂饮食联合STZ 腹腔注射下，成功造模DN 大鼠，在对肾脏组织进行免疫组织化学染色时，观察到DN 组大鼠ERS 相关蛋白ATF6、IRE1、PERK 表达较正常组显著增多，ERS 被激活，表明DN 与ERS相互促进并相互影响。

当异常折叠蛋白蓄积时，ATF6、IRE1、PERK三种跨膜蛋白与GRP78 解离，处于激活状态，进而促进Caspase12、Caspase9、Caspase3 级联促凋亡反应及CHOP 依赖性凋亡途径的发生，促进细胞死亡，参与疾病的发生［16］。CHOP 是UPR 3 种途径共同的下游因子，过度激活状态下的UPR 促发CHOP基因转录，CHOP 过量表达，进而下调BCL-2（凋亡抑制因子，可促进细胞存活），上调促凋亡蛋白BIM，诱导线粒体凋亡途径的发生［17］。本研究在检测UPR 3 种跨膜蛋白的基础上，检测共同下游因子CHOP 及凋亡蛋白Caspase3，意图探索ERS 损伤DN 肾脏细胞的机制是否通过促进凋亡来实现。实验结果表明，DN 组大鼠ERS 相关蛋白表达增多的同时，CHOP 及Caspase3 表达亦增加，DN 的发病机制可能与RES 促肾脏细胞凋亡相关。Ju 等［18］通过黄芪甲苷对糖尿病大鼠进行干预，提示下调p-PERK、ATF4 和CHOP 的表达可抑制ERS 诱导的肾脏细胞凋亡。因此推测抑制ERS 的过度激活，可减少细胞损伤及凋亡的发生。

小檗碱是传统中药黄连的主要药效成分，Yan等［19］在对溃疡性结肠炎的研究中，证明BBR 可通过抑制ERS 有效降低溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜中IEC 的凋亡率；Wu 等［4］在对阿尔茨海默病的研究中发现小檗碱可通过抑制ERS，发挥对阿尔茨海默症的保护作用。虽然已有大量研究表明小檗碱具有抑制ERS 的作用，但其在糖尿病肾病方面的相关报道尚少。本实验通过生化、组织病理、透射电镜及免疫组织化学结果证实ERS 参与DN 的发生、发展，并通过设置小檗碱干预组，对比检测各组大鼠肾脏组织内ERS 相关蛋白：PERK、ATF6、IRE1、CHOP、Caspase3 的表达水平，总结出小檗碱可减轻ERS 发挥对肾脏组织的保护作用。

综上所述，小檗碱可能通过调控ERS 相关蛋白的表达调控细胞凋亡，发挥对DN 大鼠肾脏保护作用，为小檗碱临床治疗DN 提供了一定依据。但本研究未设置小檗碱浓度梯度，也未设置药物对照组例如：ERS 抑制剂—四苯基丁酸（4-PBA），同时本实验对于凋亡蛋白的检测尚少，在后续研究中，将继续完善相关的实验检测指标，设定药物阳性对照组及药物浓度梯度，进一步探讨小檗碱对DN 的治疗作用及相关的其他分子机制。