基于网络药理学和分子对接探讨二仙汤治疗卵巢早衰的作用机制

李 煜，黎小斌，曹晓静

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405；2.广东省中医院，广东 广州 510105）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）指女性在从初潮开始至40 岁之前出现闭经3 个月或更长时间，促性腺激素水平升高（至少两次间隔1 个月FSH＞40 IU/L）和E2水平降低（低于50 pg/mL）［1］。其病因复杂且尚未完全明确，现代研究提示常见病因包括染色体异常和基因变异、医源性因素（包括手术及放化疗［2］）、自身免疫因素、不良环境或不良生活方式等，是早发型卵巢功能不全的终末阶段［3］。随着现代女性生活节奏的加快及工作压力的增大，近年来POF 的患病率呈上升趋势且发病年龄呈年轻化发展，其带来的并发症如骨质疏松、心血管疾病发生率增加、阴道干涩不适、泌尿系统症状等给现代女性的生理和心理都带来了不容忽视的影响。早发现并对其进行治疗，可以减缓甚至于逆转POF的发生、发展。

祖国医学中并无POF 这一病名，根据其临床表现多归属于“血枯经闭”、“月经过少”、“不孕”等范畴。肾藏精，主生殖，卵泡的发育需要肾精的滋养，肾阳则是促卵排出的动力。故肾虚被认为是卵巢早衰的主要病机。二仙汤出于《中医方剂临床手册》，是张伯讷教授为更年期综合征、更年期高血压而创制的经方。方中有益肾壮阳，补益精血的仙茅、淫羊藿（仙灵脾）、巴戟天，有泻肾火、滋肾阴的黄柏、知母，配合温润养血、调冲任的当归。此方补阳药和滋阴药同用，共奏温肾填精、调和冲任之效。近年来不乏对二仙汤治疗卵巢早衰的临床观察及研究，均表示该方对卵巢早衰的疗效确切［4］，并有助于改善患者性激素水平。但关于二仙汤药理作用的研究相对较少，对POF 的有效成分、作用靶点和机制更是不明确。

网络药理学（network pharmacology，NP）由英国药理学家Andrew L. Hopkins 在2007 年率先提出。NP 是基于系统生物学理论体系，从生物网络的角度阐明叙述疾病发生、发展的过程，通过选取特定信号节点对药物进行多靶点药物分析，从整体认识药物与机体的相互作用，进而提高药物疗效、降低毒副作用以及指导新药的发现。中药复方指两种或两种以上的中药混合制剂，是以中医基础理论为指导，根据复杂的配伍原则形成的，其中涉及多个药效物质的活性成分、靶点及通路等信息，故不能单凭方中的任一味药效的强弱来判断方剂的有效性。正因其整体性、系统性地构建“药物-靶点-疾病-靶点”网络体系来展示中药复方的作用机制，与中医从整体进行辨证施治的原则不谋而合，目前已被广泛运用于方剂的研究中。因此，本研究拟从网络药理学及分子对接的角度阐释二仙汤治疗卵巢早衰的作用机制，并寻找可能的作用靶点，为临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 二仙汤药物活性成分及靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），以OB（oral bioavailability，OB）≥30%、DL（drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，对二仙汤中的6 味中药的活性成分和靶点进行检索。再通过蛋白质数据库（Uniprot）将物种限定为人，进而对各个靶点对应的基因进行校正并获得标准化的名称简写。

1.2 卵巢早衰疾病靶点的筛选

以“Premature ovarian failure”为关键词，在基因名片数据库（GeneCards）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、药物基因组学知识库（PharmGkb）、Drug-Bank 数据库等相关数据库进行检索，去除重复及假阳性的靶点后取并集，得到疾病靶点基因的数据集合。

1.3 二仙汤对卵巢早衰作用靶点的预测

将卵巢早衰疾病基因与二仙汤药物共同靶点用Venn R 进行对比分析，将疾病与药物的交集靶点用Venn 图展现出来，以交集靶点作为桥梁构建中药复方的调控网络。

1.4 二仙汤“活性成分-靶点”中药复方调控网络的构建

将药物活性成分信息、交集靶点基因以及POF靶点基因导入Cytoscape 3.8.0 软件，构建绘制“活性成分-靶点”的调控网络，展示二仙汤中活性成分与POF 疾病基因的相关性大小。

1.5 卵巢早衰疾病基因与二仙汤药物共同靶点的蛋白质互作网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建

将1.3 中获得的交集靶点导入String 数据库，建立PPI 网络。再将所获取的信息以tsv 形式导入Cytoscape 3.8.0 软件中根据度值（Degree）进行精简分析，构建PPI 核心网络。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

将基因简写（symbol）转化为基因ID（EntrezID），再运用R 软件对“药物-疾病”基因进行GO 富集和KEGG 通路富集分析，并绘制相关的作用通路图。

1.7 活性成分与靶点基因的分子对接验证

在有机小分子生物活性数据库（PubChem）中获得二仙汤对卵巢早衰相关靶点活性成分2D 结构，运用ChemOffice 转化为3D 结构。在蛋白质结构数据库（PDB）中获得靶点的3D 结构。运用Py-MOL 软件完成对蛋白受体结构去水分子及无效小分子配体等处理。最后运用Vina 进行分子对接，获得二仙汤中活性分子与受体蛋白的结合关系和结合位置。

2 结果

2.1 二仙汤有效活性成分的筛选

在TCMSP 数据库中检索出二仙汤中所有药物共728 个化合物，其中巴戟天174 种，当归125 种，黄柏140 种，仙 茅78 种，淫 羊 藿130 种，知 母81 种，经OB、DL 值筛选得到104 个有效化学成分，其中巴戟天20 种，当归2 种，黄柏37 种，仙茅7 种，淫羊藿23种，知母15 种。经过删除无作用靶点的化合物及重复靶点后，共获得91 个有效活性成分，见表1。

表1 二仙汤中药物活性成分Tab 1 Active ingredients in Erxian Decoction

续表

2.2 卵巢早衰疾病基因的筛选

在GeneCards、OMIM、PharmGkb、DrugBank 等数据库中以“premature ovarian failure”为关键词进行查找，其中GeneCards 数据库检索的基因以relevance score＞1.0 过滤。将4 个数据库查找检索到的基因经过取并集去重复等处理后，共得到3 882 个POF 的基因靶点，绘制Venn 图，见图1。

图1 卵巢早衰疾病基因Fig 1 Premature ovarian failure disease genes

2.3 “药物靶点-疾病基因”交集作用靶点的预测

通过Rx64 4.0.4 对二仙汤有效活性成分对应的基因靶点以及卵巢早衰疾病基因靶点进行Venn 分析，最终得到184 个直接或间接的显效靶点基因交集，见图2，包括NR3C1、JUN、RB1、TP53、FOS、CDKN1A、TNF 等靶点。对图2 进行分析计算后得到二仙汤治疗POF 的靶点基因映射率为85.91%，表明其具有明显特异性。

图2 二仙汤与卵巢早衰的184 个交集靶点Venn 图Fig 2 Venn diagram of 184 intersection targets between Erxian Decoction and premature ovarian failure

2.4 “活性成分-靶点基因”调控网络的构建

运用Cytoscape 软件构建“二仙汤各药物-卵巢早衰疾病靶点”网络图，见图3。度值（degree）越大，其在调控网络中的作用越大。由图3 可见该网络由182 个潜在靶点基因和68 个活性成分组成，其中红色为巴戟天中活性成分，浅绿色为黄柏中活性成分，紫色为仙茅中活性成分，蓝色为淫羊藿中活性成分，深绿色为知母中活性成分。每个潜在的靶点基因都与多个活性成分相互作用，体现了二仙汤是通过多途径、多成分、多靶点来干预治疗卵巢早衰。

图3 二仙汤治疗卵巢早衰“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络图Fig 3 Visual network diagram of"drug-ingredient-target-disease" for treating premature ovarian failure with Erxian Decoction

2.5 二仙汤与POF 交集靶点PPI 网络的构建

将通过Venn R 分析后的184 个交集基因导入String 数据库，将物种设置为Homo sapiens，并设置medium confidence 提高至0.900，去除游离节点，得到“二仙汤-卵巢早衰”的蛋白互作网络图，见图4。该网络由164 个节点（node）、753 条边（edge）构成，平均节点度值为9.19。PPI 网络图再一次表明二仙汤的治疗是通过多途径、多成分、多靶点作用于POF 的。

图4 “药物-疾病”交集靶点的蛋白互作网络图Fig 4 Protein interaction network diagram of"drug-disease" intersection targets

将所获取的PPI 网络图以tsv 的形式导入Cytoscape 3.8.0 软件中，利用CytoNCA 对节点进行中心性（betweenness centralities，BC）、接 近 中 心 性（closeness centralities，CC）、度中心性（degree centralities，DC）、特征向量中心性（eigenvector centralities，EC） 、局 部 边 连 通 性（local average connectivity-based centralities，LAC）、网 络 中 心 性（network centralities，AC）数值计算两次，选择数值大于中位值的节点构建PPI 核心图，见图5。最终的核心PPI 由15 个节点、73 条边构成，平均节点度值为9.73，根据度值由大到小排列：NR3C1、JUN、RB1、TP53、FOS、CDKN1A、ESR1、AKT1、MAPK1、TNF、CCND1、RELA、MAPK14、MYC、MAPK8，以上核心靶点被认为在治疗卵巢早衰是发挥着主要作用。

图5 经Cytoscape 软件可视化的蛋白互作核心图Fig 5 Core map of protein interaction visualized by Cytoscape software

2.6 GO 富集注释

先运用R 软件将靶点基因名称转换为靶点基因ID。对二仙汤治疗POF 的核心靶点基因进行GO 富集分析并绘制气泡图，横坐标为基因比例，纵坐标为富集在每个GO 上的基因数目，富集结果的-log10（Q value）值以颜色表示，气泡大小表示基因的Count 值，见图6。

图6 二仙汤治疗卵巢早衰GO 富集气泡图Fig 6 GO enrichment bubble chart of Erxian Decoction in the treatment of premature ovarian failure

生物过程（biological process，BP）的富集结果提示交集基因主要参与对药物的反应、对金属离子的反应、对氧化应激的反应、细胞对化学应力的反应、对脂多糖的反应等生物反应。

细胞定位（cellular component，CC）的富集结果提示交集基因主要分布在细胞膜筏、细胞膜微结构域、细胞膜区域、细胞外膜、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等细胞部位。

分子功能（molecular function，MF）的富集结果提示交集基因主要通过与DNA-结合转录因子、RNA 聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子、泛素蛋白连接酶、核受体的结合发挥其作用。

体现了二仙汤可能是通过调控多个GO 功能来治疗卵巢早衰。

2.7 KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析结果显示共获得174 条信号通路，在所富集的通路中查找与POF 相关通路卵巢类固醇生成绘制通路图，见图7。设置具有统计学意义（P＜0.05，若不符合用Q value 校正）筛选出前29 条信号通路，绘制气泡图进行可视化分析。气泡大小代表富集的基因个数；气泡颜色代表-log10（Q value）值，见图8。图中提示主要涉及的信号通路有人巨细胞病毒感染通路、疱疹病毒感染通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、液体剪切应力和动脉粥样硬化通路、乙型肝炎通路等。可以表明二仙汤通过多通路协同作用于卵巢早衰。选取图中相关性较大的糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路绘制通路图，见图9。

图7 二仙汤Ovarian Steroidogenesis 信号通路潜在靶基因KEGG 分析图Fig 7 KEGG analysis of potential target genes of ovarian steroidogenesis signaling pathway in Erxian Decoction

图8 二仙汤治疗卵巢早衰的KEGG 信号通路气泡图Fig 8 Bubble diagram of KEGG signaling pathway in the treatment of premature ovarian failure with Erxian Decoction

图9 二仙汤AGE-RAGE 信号通路潜在靶基因的KEGG 通路分析Fig 9 KEGG pathway analysis of potential target genes of Erxian Decoction AGE-RAGE signaling pathway

2.8 活性成分与靶点基因的分子对接模拟

根据度值及查询POF 基因研究相关文献，筛选出PPI 核心网络中的4 个核心靶点基因，通过二仙汤“活性成分-靶点基因”网络选取其4 个主要活性成分和进行分子对接验证，对接结果见表2。表中结合能（affinity）越小，配体与受体的结合越牢固。一般认为当Affinity＜—4.25 kcal/mol 时说明配体与受体有一定的结合活性，Affinity＜—5.0 kcal/mol时有较好的结合活性，Affinity＜—7.0 kcal/mol 时有强烈的结合活性。分析结果显示，二仙汤中主要活性成分与疾病核心靶点的结合能介于—5.3 kcal/mol 至—9.8 kcal/mol 之间，说明方中主要的活性成分与疾病的核心基因靶点具有较好的结合活性，本次预测的结果较可靠。

表2 主要活性成分核心靶点和分子对接结果Tab 2 Core targets and molecular docking results of main active ingredients

运用PyMOL 软件对靶点基因结合活性最强有效成分对接结果进行可视化，结果见图10。

图10 主要活性成分与核心靶点的对接模式图Fig 10 The docking mode of the main active ingredients and the core targets

3 讨论

卵巢作为产生并排出卵泡、分泌甾体激素的生殖器官，在女性生殖及内分泌系统中均扮演着重要角色。而POF 是临床上常见的生殖内分泌疾病，在我国的发病率为1%～3%［5］，并且随着现代生活压力增大和生活节奏增快，其发病率呈上升趋势。POF 远期对心血管、骨骼、免疫及心理等多个系统的影响不容小觑［6］。POF 病因和发病机制至今仍无法完全明确。近年来研究表明POF 发生、发展的病因主要与遗传因素、免疫、医源性和生活方式相关。其中遗传学因素和免疫因素起着重要作用，基因异常表达或信号通路异常与POF 的发生发展关系密切。现代医学首选激素替代疗法治疗POF，虽然见效快，但会增加子宫内膜癌［7］、乳腺癌［8］等激素依赖型疾病的发生风险。而且停药后症状容易反复，无法从根本上解决内分泌紊乱的情况。研究分析［9］，中医药治疗可以通过调控相关基因表达改善免疫状态，干预生殖内分泌网络调整性激素水平，改善卵巢形态及血液循环进而恢复部分功能，配合激素治疗还可减轻其不良反应。二仙汤全方共奏滋肾阴、降相火、调冲任、平阴阳之效，无论是在临床或是实验研究方面都取得了一定的成果。陶仕英等［10］发现二仙汤能够上调卵巢中卵泡颗粒细胞ERβ 的表达，改善卵巢功能及内分泌状态，促使卵泡发育排出。还能参与整个女性的生殖周期，主要是通过作用于下丘脑-垂体-卵巢轴，对下丘脑促性腺激素的合成分泌进行反馈调节实现的［11］。本研究通过数据库及软件，从活性成分、靶点基因以及信号通路的角度对二仙汤治疗卵巢早衰的作用机制进行分析阐述。

根据“活性成分-靶点基因”网络图中可见，二仙汤中起作用的主要活性成分共68 个，其中槲皮素是存在于人类饮食中有生物活性的一种多黄酮类化合物，可调节许多与疾病进展相关的细胞内外信号通路［12］，是流行病学家认为的最有望应用于预防和治疗疾病的天然化合物［13，14］。黄长盛等［15］实验发现槲皮素能够促进各级卵泡的发育，其通过促进颗粒细胞增殖，增加颗粒细胞中雌激素的分泌来改善卵巢功能。槲皮素还能够抑制TLR/NF-κB 信号通路，降低血胰岛素水平和白介素-6、肿瘤坏死因子等炎性因子水平，改善胰岛素抵抗和炎症状态［16］。木犀草素、山柰酚均为黄酮类化合物，能够通过抑制肝脏、脂肪组织中的11β-HSD 酶，避免胰岛素抵抗的发生［17］。卵巢上分布着胰岛素受体，胰岛素抵抗状态能够进一步影响卵巢功能。山柰酚可通过激活AMPK/Nrf2/HO-1 信号通路，降低氧化应激和炎性反应［18］。豆甾醇作为植物甾醇，与雌激素在化学结构上有相似之处，而卵巢早衰患者体内的雌激素水平较正常女性低，推断可能是通过类雌激素作用改善POF 患者的卵巢功能。另外，度值较高的活性成分还有脱水淫羊藿素、谷固醇、异延胡索单酚碱、豆甾醇、薯蓣皂苷配基等，表明这些物质在改善卵巢功能中起主要作用，可能是二仙汤治疗POF 的有效成分，但由于对这几种成分的研究较少，故作用机制尚不明确。

通过PPI 核心图得到RB1、TP53、CDKN1A、ESR1、AKT1、MAPK1、TNF 等15 个与卵巢早衰疾病关系较为密切的靶点基因。

CDKN1A基因参与细胞周期调控，Geng 等［19］认为CDKN1A基因的异常转录使卵巢颗粒细胞被抑制，导致卵泡成熟异常，进而影响卵巢功能。ESR1，即雌激素受体alpha 基因，能够介导雌激素发挥生物学作用。有研究提出ESR1 因其中的相rs2234693 与POF 相关性大，所以相较于其他基因更 应 被 关 注［20］。一 项 对155 例 中 国POF 患 者 的 研究发现患病组ESR1 基因中的PvuⅡ位和XbaⅠ位多态性的发生率明显高于对照组，是POF 潜在的危险因素［21］。卵巢早衰患者存在免疫功能异常，相关调控因子水平下降，卵巢组织萎缩，颗粒细胞分泌受到抑制，功能下降［22］。熊鹿等［23］观察研究表示POF 患者的TNF-α 水平较正常女性低。王雪金等［24］提 出POF 的 发 生 可 能 与TNF-a-308G/A 基 因多态性有关，是发病易感基因。TP53表达的转录因子可调节多个基因的表达，进而调控细胞周期、维持基因组稳定性、诱导细胞分化和凋亡［25］。AKT基因是调控细胞周期和凋亡的重要基因，胰岛素等因子可以激活AKT信号通路。研究表明，卵巢中PI3K/AKT/mTOR 信号通路转导的异常与胰岛素水平缺陷及胰岛素抵抗状态相关，该通路参与细胞增殖和炎症反应发生，AKT 基因是通路中的关键靶点［26］。此 外，本 研 究 分 析 中 提 示NR3C1、JUN、FOS、CCND1、RELA、MAPK14、MYC、MAPK8等基因与POF 相关性亦较密切，其作用有待更加深入的研究以明确其作用机理，为预防及治疗POF 提供新思路。

基于KEGG 通路富集分析发现，二仙汤治疗POF 的潜在作用机制处理直接作用于卵巢类固醇生成通路外，还包括PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路等与卵巢早衰的发生发展相关的信号通路。PI3K-Akt 信号通路是细胞中经典的信号通路，该通路可通过调控下游分子的活性对细胞周期进行中心调控作用。作为POF 的重要通路之一，PI3K-Akt通路参与原始卵泡的发育、颗粒细胞的增殖凋亡以及卵母细胞的生长过程［27］。PI3K-Akt 下游通路中的Fox、mTOR 表达异常可过早、过度激活原始卵泡，导致卵泡池过度消耗，从而降低卵巢储备，加速POF［28，29］。所以该信号转录过程异常会导致原始卵泡生长发育出现缺陷，颗粒细胞分化异常，进而造成卵巢功能下降的病理状态［30］。MAPK 信号通路介导细胞外信号到细胞内的反应，在卵泡生长发育的过程中起重要的调节作用。研究分析［31］MAPK信号通路与颗粒细胞膜上的特异性受体结合后，能够调节女性性激素的合成分泌，调控卵母细胞的增殖、凋亡，进而抑制POF。晚期糖基化终末产物（AGEs）及其受体协同的AGEs-RAGE 信号转导通路是近年的研究热点之一，该通路通过激活其下游信号通路，表达并释放大量生长因子、炎性因子等，诱发氧化反应和炎症反应，最终引起细胞及组织的损伤［32］。另外有研究发现在肝癌、胃癌、肺癌等恶性肿瘤患者中，RAGE 异常表达有所增加，这提示该通路可能与肿瘤细胞的增殖、凋亡、远处转移及肿瘤分期密切相关［33］。流体剪切应力和动脉粥样硬化通路是通过调节内皮细胞中基因和蛋白的表达［34］，改变血管内皮细胞的分化、形态以及血管壁通透性，进而影响血流动力学。由此推断该通路可能是通过影响卵巢局部血供情况，导致卵巢功能异常，进而发展为POF。

本研究基于网络药理学的角度，将生物信息学技术与传统中医理论结合，分析二仙汤复方中药的化学成分、有效活性成分及靶点，疾病的靶点基因，并且运用相关软件分析与构建作用网络及通路。筛选出的活性成分主要有槲皮素、木犀草素、山柰酚、脱水淫羊藿素、谷固醇等，其中TP53、ESR1、AKT1、MAPK1、TNF、CDKN1A等靶点基因通过PI3K-Akt、MAPK 等信号通路对原始卵泡的发育和卵母细胞的生长进行调控，以及通过体内炎症因子的表达，调整卵巢局部炎症反应等。综上，可以得到二仙汤通过多成分、多靶点及多通路的协同作用治疗POF，为临床上对二仙汤治疗卵巢早衰的进一步深入研究提供一定的思路及依据。