RNA特异性腺苷脱氨酶1与Caveolin 1在脓毒症相关肝损伤中的作用及机制

尹朝奇，陶如意，王少华，陈佳，唐封杰，刘灿，刘岱松，陈舒悦，周建大，陈丰原

（中南大学湘雅三医院烧伤整形科，湖南长沙 410013）

脓毒症相关肝损伤（sepsis related liver injury，SRLI） 的治疗仍是医学界重大难题，深入研究SRLI 的发病机制尤其是探明早期发病机制以及寻找新的治疗方法对SRLI 具有重要意义。在脓毒症病理条件下， 肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）总是暴露于循环的病原体和细菌内毒素（lipopolysaccharide，LPS），血管内皮细胞作为血液与全身组织细胞信息交换的界面，最先受到代谢物质及其引发的系统性炎症损害，从而导致内皮功能障碍[1-3]。

前期研究[4]发现RNA 特异性腺苷脱氨酶1（ADAR1）作为一种全新的血管调节分子在血管生长、发育以及血管再生中具有重要作用。腺苷脱氨酶是与双链RNA（dsRNA）结合并通过脱氨将腺苷（A） 转化为肌苷（I） 的酶。研究[5-6]还发现，体外血管内皮细胞中下调ADAR1 可致质膜微囊蛋白Caveolin 1（Cav-1）明显下调，Cav-1 是一种特化的细胞质膜结构，在血管内皮细胞存在丰富，其在内吞、膜转运以及信号转导等过程中发挥关键作用。那么ADAR1 及Cav-1 是否参与了SRLI 目前未见文献报道。

考虑到LSECs 在肝损伤中起着至关重要的作用，本研究观察了ADAR1 缺乏在LPS 诱导的肝损伤中对LSECs 的作用，并探讨ADAR1 在LPS 诱导的肝损伤中的作用及相关机制，以期为临床早期防治SRLI 开拓新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

ADARl 内皮特异性敲除小鼠（ADAR1ECKO小鼠） 由本实验室自行培育，ADAR1flox/flox野生型小鼠、 高表达ADARl 基因腺病毒（adenoviruses expressing ADARl gene，Ad-ADARl） 由美国匹兹堡大学Qing Dewang 副教授友情提供。所有基因工程小鼠经过严格标准化PCR 鉴定，按文献[7]方法体外培养的原代LSECs。其他实验材料与仪器包括：Anti-ADAR1 Antibody （Abcam，英国）、RIPA 裂解液（Servicebio，中国）、50×Cooktail （Servicebio，中国）、PMSF（Servicebio，中国）、磷酸化蛋白酶抑制剂（Servicebio， 中国）、 显影定影试剂（Servicebio，中国）、BCA 蛋白定量检测试剂盒（Servicebio，中国）、TRIzol （Life Technologies，美国）、M-MLV（promega，美国）、dNTPs（Promega，美国）、oligo dT（生工，中国上海）、Bulge-LoopTM miRNA （锐博， 中国广州）、 Rnase Inhibitor（Promega，美国）、SYBR Master Mixture （Takara，日本）、胎牛血清（Ausbian，澳大利亚）、DMEM（Corning，美国）、胰酶（上海化学试剂有限公司，中国上海）、酶标检测仪（Rayto，美国）、冷冻离心机（Heal Force，中国）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司，中国北京）、Nanodrop 分光光度计（Thermo，德国）、Real time PCR 仪（Agilent，美国）、 96 孔板（Cornning， 美国）、 扫描仪（EPSON，日本）。

1.2 实验方法

1.2.1 总体设计 取ADAR1ECKO小鼠和ADAR1flox/flox野生型小鼠各20 只，腹腔注射20 mg/kg LPS 建立脓毒症小鼠模型，在LPS 处理6 h 后，每组各处死10 只小鼠后采集肝脏组织，并分离LSECs，用于组织形态学与免疫荧光检测，每组剩余10 只用于生存率观察。取正常野生型小鼠的LSECs 转染ADARl siRNA，以转染siRNA 阴性序列及无转染的LSECs为对照，观察LSECs 增殖能力及Cav-1 下游蛋白VE-cadherin 与β-Catenin 表达的变化。

1.2.2 组织病理 将福尔马林固定的肝脏标本进行石蜡包埋，采用HE 染色进行评价。所有的照片均用Olympus Provis 显微镜拍摄。

1.2.3 LSECs 分离培养及转染方法 取新鲜离体小鼠肝组织，分离培养并鉴定细胞为血管内皮细胞，将细胞放置在37 ℃，5% CO2的环境下EGM-2 培养基中，培养2～3 代，接种至6 孔板[7]。取生长良好的3～8 代用于实验，培养细胞时隔天用新鲜培养基换液，并待细胞生长到80%密度时可传代继续培养。转染ADARl siRNA 24 h 前，在2 mL 无抗生素EGM-2 培养基中接种106个细胞，转染时细胞融合度为80%。转染时，将50 nmol/L ADARl siRNA、对照siRNA 和6 µL LipofectamineTM 2000 混合加入到200 µL opti-MEM 培养基中，室温下静置30 min。细胞板opti-MEM 漂洗2 遍后，转染复合物加入到细胞板，前后摇晃混匀。转染48 h 后即进行实验。ADARl siRNA 序列：5´-CAU CAA AUG CCU CAA AUA A-3´（Dhamacon）。

1.2.4 Western blot 检测小鼠LSECs 的ADAR1 及相关蛋白表达水平 提取细胞总蛋白溶液，加入蛋白质上样缓冲液（2∶1）后沸水浴10 min，以10 µL 每孔进行上样电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温下孵育30 min 后，TBST 漂洗3 次。避光，显色，凝胶成像仪中拍照。扫描存档，PhotoShop 整理去色，Alpha 软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.2.5 细胞免疫荧光 首先将转染ADARl 的肝内皮细胞种植在玻璃片上，然后用4% PFA 室温下固定30 min，PBS 漂洗2 次后，0.1% TX-100 室温下作用1～2 min 使细胞膜通透。然后将玻璃片置于湿盒中，用5%BSA/TBS 封闭30 min，PBS 漂洗3 遍。接着将一抗稀释在1% BSA/TBS（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片加50 µL 抗体稀释液，4 ℃孵育过夜。过夜后PBS 漂洗3 遍，将二抗稀释在1%BSA/TBS 中，每个玻璃片加50 µL 二抗稀释液，常温下30 min，最后滴加DAPI 染核5 min，加上封片胶后用载玻片封片在激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.6 内皮细胞小管形成检测 先将Matrigel 放入40 ℃冰箱过夜待其融化。96 孔板和枪头提前置于-20 ℃冰箱预冷。第2 天取50 µL Matrigel 加入冷冻的96 孔板中，静止后放入37 ℃孵育待其凝固。分别取消化的siR-对照组、空白对照组、siADAR1 组肝内皮细胞后计数，将2.5×104细胞接种于Matrigel上，利用EGM-2 培养，置于37 ℃孵箱孵育6 h。最后在显微镜下照相，计算小管的数目。小管计数时以长是宽的4 倍及以上作为小管的标准。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示。两组之间的比较采用非配对t检验。大于两组之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Neuman-Keuls 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LPS处理后两组小鼠的成活情况

将ADAR1flox/flox和ADAR1ECKO小鼠用20 mg/kg LPS 腹腔注射， 生存监测结果发现， 10 只ADAR1ECKO小鼠在40 h 后全部死亡，而ADAR1flox/flox小鼠在3 d 内仍有7 只存活。统计分析结果显示， ADAR1ECKO小鼠死亡时间早于ADAR1flox/flox小鼠（P<0.05），存活率明显低于ADAR1flox/flox小鼠（P<0.05）。

2.2 LPS处理后两组小鼠肝脏组织形态学变化

ADAR1flox/flox组小鼠肝组织结构和肝细胞间隙均未见明显异常，肝索走向正常；ADAR1ECKO组小鼠肝细胞胞质内可见圆形空泡，炎细胞浸润，肝索紊乱，大部分细胞坏死。因此，ADAR1ECKO小鼠的肝损伤比ADAR1flox/flox小鼠更严重（图1）。

2.3 LPS 处理后两组小鼠内皮细胞Cav-1 和VEcadherin的表达

LPS 处理后的ADAR1ECKO小鼠LSECs 中Cav-1 和VE-cadherin 的表达明显低于对照组ADAR1flox/flox小鼠，说明内皮细胞缺失ADARl 可抑制肝脏血管内皮细胞相关蛋白 Cav-1 和 VE-cadherin 的表达（图2）。

2.4 沉默ADAR1后LSECs的增殖能力

与空白对照组比较，siR-ADAR1 组镜下细胞成血管网稀疏，内皮细胞增殖、小管形成功能抑制；对照siRNA 组与空白对照组间无明显差异（图3）。

2.5 Western blot 检测LSECs转染siRNA后Cav-1下游蛋白的表达

与空白对照组比较，LSECs 转染ADARl siRNA后，ADARl 与VE-Cadherin 表达下调，但β-Catenin的表达无明显变化；对照siRNA 组与空白对照组间各蛋白表达水平无明显差异（图4）。

3 讨 论

SRLI 发生率高，往往发展为多器官功能障碍，导致病死率显著增加，是急危重症领域内的救治难题[8-10]，因此，深入研究SRLI 的发病机制尤其是探明早期发病机制以及寻找新的治疗方法对SRLI具有重要意义[11-12]。

SRLI 的发病机制是肝内皮细胞在受到有害刺激时（如脓毒症及其引发的炎症和代谢紊乱等因素），产生内皮细胞应激反应，炎症细胞因子激活嗜中性粒细胞释放损伤相关分子模式和炎症介质，活化的补体系统最终形成膜攻击成分并损伤内皮细胞[13-16]。因此，内皮细胞应激是导致SRLI 早期的关键步骤，寻找SRLI 血管内皮应激过程中起关键作用的生物分子，阐明其作用机制，从内皮细胞应激的启动、调控、干预等环节建立早期预警体系，将最终为SRLI 早期防控提供方向[17-20]。

前期研究[15]发现ADAR1 作为一种全新的血管调节分子在血管生长、发育以及血管再生中具有重要作用。腺苷脱氨酶是与dsRNA 结合并通过脱氨将腺苷（A） 转化为肌苷（I） 的酶[21]。ADAR1是ADAR 家族中定义最明确的成员，它有两个亚型：P110 和P150[5]。ADAR1 于1994年从牛肝脏中被鉴别和分离出来，由于其在体内的广泛的编译作用，近年研究发现其在多个功能领域具有重要作用，越来越受到重视，最新的研究主要包括炎症损伤与免疫调控[4,22-23]，ADAR1 可被多种炎症刺激激活， 并已被证实参与局部和全身炎症反应[24-25]。

为了观察ADAR1 表达对脓毒症小鼠肝损伤的影响，本研究将ADAR1flox/flox和ADAR1ECKO小鼠用20 mg/kg LPS 腹腔注射，生存监测结果显示，ADAR1ECKO小鼠死亡早于ADAR1flox/flox小鼠，存活率显著低于ADAR1flox/flox小鼠。 对LPS 刺激的ADAR1flox/flox和ADAR1ECKO小鼠中肝组织学分析显示，ADAR1ECKO小鼠的肝损伤比ADAR1flox/flox小鼠更严重。提示ADAR1 在SRLI 的发病机制起了重要作用。细胞免疫荧光技术观察发现：通过检测发现LPS 处理后的ADAR1ECKO小鼠Cav-1 和VE-cadherin 的表达显著低于对照组ADAR1flox/flox小鼠，提示ADARl与Cav-1/VE-Cadherin 通路密切关联。

研究[20,26-28]发现，Cav-1 是细胞表面的小窝样内陷结构（Caveolae）的标志性蛋白，是一种特化的细胞质膜结构，在血管内皮细胞存在丰富，其作为小窝主要的结构和调节成分，在生理情况下，能够与细胞膜及小窝上的eNOS 稳定结合，抑制其活性从而实现其对下游蛋白分子活性的负向调控。本研究利用ADAR1 敲除策略，初步检测了ADAR1在体外培养的原代LSECs 中的作用。结果显示，与对照组比较，si-ADAR1 组镜下细胞成血管网稀疏，内皮细胞增殖、小管形成功能抑制；Cav-1 下游蛋白VE-Cadherin 表达下调，但β-Catenin 的表达无明显变化。提示ADARl 在SRLI 中的作用可能与其调控Cav-1/VE-Cadherin 通路的活性有关。

综上所述，根据前期研究积累及实验结果，结合SRLI 发病机制研究的最新进展，笔者提出以下假说：脓毒症导致的内皮细胞应激是其继发SRLI 的早期关键机制，脓毒症状态下，肝内皮细胞受缺氧刺激致ADAR 下降，继而通过Cav-1/VECadherin 途径造成LSECs 屏障损伤，继而可能导致一系列反应，如组织因子增加，激活外源性凝血途径促使血小板活化聚集等，进一步加快了肝损伤的进展。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。