基于网络药理学探讨银杏叶防治失重性心肌萎缩的作用机制

穆玉雪，危冬昱，陈 涛，薛军辉

(空军军医大学航空航天医学系航空航天临床医学中心，陕西 西安 710032)

失重性心肌萎缩是由于航天失重等去负荷引起的心脏结构与功能的改变，主要表现为心脏细胞的超微结构、细胞骨架、收缩与分泌功能改变，引起心肌代谢功能紊乱，参与心肌重塑的心肌成纤维细胞胶原表达与分泌及其生长因子的表达受影响，导致心肌细胞信号通路的改变，心肌出现萎缩和心律失常，最终导致心脏功能减退[1]。心肌细胞能够应对内外环境改变而发生重塑。在航天飞行或模拟失重条件下，心脏体积和质量会发生显著改变，从而影响心脏功能，导致功能下降，其中心肌萎缩是心脏功能下降的重要原因之一，这最终造成航天员返回地球后立位耐力下降[2-3]。因此，积极寻找应对航天特因环境下导致心脏重塑发生的分子机制并提出有效的对抗措施是今后航天医学研究的重大课题。心肌萎缩可归属于中医学“痿证”范畴，主要病机为后天失养，从而导致肌肉以及筋脉失养出现的疾病[4]。

银杏叶为银杏的干燥叶子，其性平，味甘苦涩，主要归心、肺经，中医常用来治疗胸痹心痛、淤血阻络等。银杏叶中含有丰富的黄酮类化合物及萜内酯化合物，现代药理研究证实银杏叶具有抗氧化、抗凋亡、改善微循环、神经保护、调节血脂等功效，且在治疗高血压[5]、冠心病[6]及心绞痛方面具有较好的疗效，是当前临床上常用的中药材之一[7-8]。目前有很多关于银杏叶可以有效医治心血管疾病的研究，且临床上在心血管方面的应用也较为广泛[9]，但对于银杏叶是否对失重性心肌萎缩具有治疗作用尚无研究。网络药理学是把生物学网络和药物产生作用的网络进行整合，从而形成一套完整的生物学理论，能够帮助人们更好地、更全面地、更科学地找到药物作用于疾病的治疗靶点[10-11]。本研究采用网络药理学技术分析银杏叶治疗失重性心肌萎缩的作用靶点，研究其相关分子机制，以期为后续的实验研究和临床试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)数据库(https:∥tcmspw.com/ tcmsp.php)；Uniprot数据库( http:∥www. uniprot. org/)；GeneCards数据库(https:∥www.genecards.org/)；在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)数据库(https:∥www.omim.org/)；STRING数据库(https:∥stringdb.org /)；Cytoscape(Version 3.7.2)可视化软件；Bioconductor 数据库(http:∥bioconductor.org/bioc Lite.R)。

1.2 方法

1.2.1 筛选银杏叶活性成分及其作用靶点 应用TCMSP数据库搜索关键词“银杏叶”，筛选其有效成分及靶标，再通过设置检索条件，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug likeness，DL)≥0.18来筛选银杏叶化合物的有效成分。

1.2.2 通过软件收集失重性心肌萎缩的相关疾病靶基因通过 Uniprot 数据库(http:∥www. uniprot.org/)将TCMSP数据库中筛选得到的银杏叶关键化学成分的信息转换成相应的靶点进行注释，借助于GeneCards数据库(https:∥www.genecards. org/)和OMIM 数据库(https:∥www.omim.org/)搜索与“失重性心肌萎缩”相关的基因。最后通过删除重复，筛选获得失重性心肌萎缩相关基因与银杏叶靶点基因的相同靶点，从而获得银杏叶活性成分治疗失重性心肌萎缩的相关核心靶点。

1.2.3 筛选共同作用靶点 为获得银杏叶潜在靶点和失重性心肌萎缩相关靶点的共同作用靶点，借助R语言和VennDiagram 数据包来取两者的交集，并且绘制韦恩图，即可得到。

1.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)的网络构建 通过将银杏叶和失重性心肌萎缩的共同靶点输入到STRING数据库(https:∥stringdb.org/)来构建PPI网络，要求将物种选为 Homo sapiens，将筛选得分设置为≥0.4，通过数据库中的高级设置来隐藏网络图中游离的蛋白质，其余参数均设置为默认，最后得到银杏叶作用于失重性心肌萎缩的PPI 网络。

1.2.5 “药物-成分-疾病-靶点”网络构建及分析 通过使用Cytoscape(Version 3.7.2)可视化软件，将失重性心肌萎缩疾病的靶点数据和银杏叶的化学成分数据输入进去，就构成了一套“药物-成分-疾病-靶点”的网络结构。通过对网络节点图当中每一个节点和边进行分析，判断疾病和药物作用之间的关系。其中节点表示银杏叶化学成分和作用靶点之间的关联，边表示银杏叶和化学成分及疾病靶点之间的相互作用关系。

1.2.6 关键靶点的基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 借助于Bioconductor数据库(http:∥bioconductor. org/bioc Lite. R)用R软件安装包获得银杏叶治疗失重性心肌萎缩的关键靶点，通过GO生物功能富集分析和KEGG富集分析将R软件的安装包进行解析，最终用R语言画图把结果呈现出来。

2 结果

2.1 银杏叶活性成分及靶点的筛选

通过利用TCMSP 数据库共获得银杏叶的有效化学成分307种，再经 OB≥30%、DL≥0.18的标准进行筛选，得到银杏叶的关键化合物27种(表1)。逐一对应靶点，得到银杏叶活性成分靶点2 166个。

表1 TCMSP 对银杏叶有效成分的筛选结果

2.2 筛选“银杏叶-失重性心肌萎缩”的共同靶点

通过OMIM数据库和GeneCards数据库查询有关于引发失重性心肌萎缩的靶点基因，通过搜索发现了655个相关性大于5的基因，然后把失重性心肌萎缩的靶点基因和银杏叶的活性分子进行比对，采用R软件安装包来制作韦恩图，得到银杏叶与失重性心肌萎缩的共同靶点43个，包括NOS2、ESR1、AR、MAPK14、NOS3、ACHE、GABRA1、MAOB、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX、JUN、CASP3、PRKCA、AKT1、ICAM1、ALOX5、SLC2A4、SLC6A3、MAOA、VEGFA、CDKN1A、IL-6、APP、PCNA、IL-2、IFNG、IL-4、CD40LG、FOS、EGF、SOD1、HIF1A、CAV1、F3、IL-1β、CXCL8、COL1A1、PARP1、CRP、SPP1、RUNX2(图1)。

图1 银杏叶作用靶点与失重性心肌萎缩靶点图

2.3 药物活性成分-作用靶点-相关疾病的网络构建

使用Cytoscape 3.7.2 软件构建了一个药物活性成分-作用靶点-相关疾病相互作用的网络结构图(图2)，通过对网络图进行分析发现银杏叶的活性成分有15个，协同作用于失重性心肌萎缩的靶点有43个，边245条。

2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选

为更进一步分析银杏叶治疗失重性心肌萎缩的作用机制，在STRING数据库中输入43个共同靶点基因，研究物种选择为“Homo sapiens”，将筛选得分设置为≥0.4，通过隐藏游离的节点，得到PPI网络图。图中节点有43个，边有 376条，平均节点自由度为17.5，平均聚集系数为0.705，通过网络图我们可以看出银杏叶对失重性心肌萎缩的治疗是通过多途径多靶点的方式。使用 R 软件将从STRING数据库里面发现的数据重新排列，从而发现核心靶点就是相互之间关联性最强的节点(图3)。推测这些靶点可能是银杏叶的关键靶点，从图3中可以看出与AKT1连线的有36条，与IL-6连线的有35条，依次是VEGFA、CASP3、IL-1β、JUN、CXCL8、EGF、FOS、MAPK14等。由此可以说明这些核心靶点之间存在较密切的关系(图4)。

图2 “药物活性成分-作用靶点-相关疾病”网络模型

图3 银杏叶-失重性心肌萎缩PPI蛋白相互作用网络靶点

靶点基因连接度(个)图4 银杏叶治疗失重性心肌萎缩的核心靶点

2.5 GO功能富集分析与KEGG富集分析

应用Bioconductor 数据库(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)，用R软件安装包对43个关键靶点进行GO生物功能分析，发现其中涉及了66种生物学功能与过程，包括细胞因子活性、细胞因子受体结合、生长因子受体结合、受体配体活性、蛋白酶绑定、蛋白质磷酸盐绑定、R-SMAD绑定、铵离子结合、生长因子活性等，并展示了前20位GO分析结果(图5)。

图5 银杏叶-失重性心肌萎缩关键靶点的GO富集分析

利用Bioconductor数据库(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)，通过对43个关键靶点采用KEGG富集分析，使用R软件安装包，根据保留P≤0.05的结果，共获得31条富集信号通路，绘制前20位KEGG气泡图(图6)，主要涉及PI3K/Akt、MAPK信号通路(图7)、HIF-1信号通路(图8)和NF-κB(图9)信号通路。

图6 银杏叶-失重性心肌萎缩KEGG富集分析气泡

图7 MAPK信号通路、PI3K/Akt通路

图8 HIF-1信号通路

图9 NF-κB信号通路

3 讨论

失重性心肌萎缩的分子机制研究相对薄弱，失重/模拟失重导致机体血流动力负荷下降、代谢需求降低和神经内分泌变化，同时导致包括钙相关信号、NF-κB通路、ERK通路、泛素-蛋白酶体途径以及自噬等通路的改变，因此会对心肌细胞的正常收缩和代谢功能造成影响，严重时会导致心肌萎缩使得心脏不再正常的工作，并最终造成航天员返回地球后立体耐力下降[12]。因此，找到一种有效对抗失重性心肌萎缩的方式成为保障航天员身体健康及提升作战效能的主要工作。

目前防治失重性心肌萎缩主要采取对症治疗，因此阐明失重性心肌萎缩的机制，并找到防治靶点成为当前防治失重性心肌萎缩的主要治疗方式。现阶段对于失重性心肌萎缩治疗多关注于西医西药，而对中医药的关注较少。早期的中医药主要是从临床实践中开始，由于中药成分复杂，分子机制及作用靶点不明确，在疾病治疗方面存在一定的限制，随着科学技术的发展，中医药朝着智能化及科学化的方向发展[13]，中医药在治疗冠心病、心律失常、心力衰竭、高血压[14]等方面具有较好的疗效且中医在治疗疾病方面讲究辨证论治及整体观念，这与网络药理学系统生物学的理念相似，对生物系统进行网络分析，将药物靶点与疾病靶点对应，这对于提高中药新药临床试验的成功率以及阐明药物对疾病的防治方面具有较好的探索，因此借助于网络药理学来明确失重/模拟失重性心肌萎缩的机制及其对抗措施具有重要的意义。

银杏叶在治疗心血管疾病方面的疗效已经被充分证实，ONG LAI TEIK等[15]研究发现银杏叶活性成分可以通过抑制NF-κB信号通路，减少细胞蛋白含量，改善心肌细胞代谢，进而抑制心室重构。银杏叶在心肌缺血治疗方面具有较好的疗效，可通过调节NF-κB、PI3K/Akt及自噬等通路发挥调节作用，从而改善缺血再灌注加重缺血导致的细胞代谢异常及功能障碍，减轻组织损伤[16]。MAIDEEN等[17]研究证实，其在改善心律失常方面也具有较好的疗效，主要通过调节钙离子、钾离子通道来调节心率失常，除此之外，银杏叶可以抑制TNF-α等促炎因子的分泌，从而上调抗炎因子的表达起到抗炎、抗动脉粥样硬化的作用[18]。对于银杏叶是否对失重性心肌萎缩起治疗作用尚无研究。

本研究通过采用网络药理学方法对银杏叶有效活性成分分析发现，银杏叶中主要的活性成分包含槲皮素、山柰酚、黄酮类等。研究发现，槲皮素在治疗心血管方面，如高血压、心肌炎、冠心病等具有较好的疗效，通过抑制心肌重塑，改善心脏功能[19]，也可以抑制NF-κB信号通路，从而改善心肌代谢。山柰酚具有抗炎和抗氧化等药理作用，在抑制NF-κB信号通路及PI3K/Akt、改善神经内分泌变化等方面起着重要作用[20]；木犀草素是黄酮类的一种，具有抗氧化、抗炎、活血化瘀、保护细胞膜稳定性的作用，可抑制NF-κB信号通路[21]。这些治疗作用证实了网络药理学对于疾病预测及药物治疗的可靠性。

本研究通过PPI蛋白网络分析，可以发现AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、IL-1β、JUN、CXCL8、EGF、FOS、MAPK14等靶点连线较多，这些即为银杏叶治疗失重性心肌萎缩的核心靶点。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，其参与多种生物学过程，主要包括细胞的代谢、细胞的增殖调控及血管生成等，这在心肌细胞的代谢调控等方面起着重要的作用[22]。IL-1β、IL-6激活NF-κB炎症反应通路,其被激活主要是由于长期的机械负荷、机体的神经体液因子和促炎细胞因子等原因引起心肌肥大,导致心率失常，心脏代谢紊乱[23-24]。VEGFA主要参与细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡，研究发现其在心肌梗死的发生发展过程中起着调控作用[25]。CASP3是参与细胞信号凋亡的关键分子之一，在细胞凋亡机制网络中处于核心地位，且有大量的研究证实其在心肌重塑、心血管功能调节等方面起着重要的调节作用[26]。JUN被称为死亡激酶，在细胞的发育、发展、凋亡中起着重要的调控作用，主要参与细胞的自噬过程，研究发现其可以在心肌损伤、心肌细胞重构等方面参与调控[27]。CXCL8是炎症细胞因子家族中的一员，其在炎症性疾病的发生发展中起到了重要的作用，并且有研究证实免疫反应在失重性心肌萎缩中起着一定的调控作用[28]。EGF在促进DNA、RNA、蛋白质合成及细胞增殖方面起作用[29]。FOS参与凋亡调控，在心肌缺血、缺氧的损伤中起着重要调控作用，有文献研究发现其可以参与调控心脏成纤维细胞的增殖[30]。MAPK14是丝裂原活化蛋白激酶家族之一，参与心肌炎症损伤的调控，其在心肌细胞的增殖凋亡中起着调控作用[31]。

本研究通过对银杏叶有用的活性成分的关键靶点采集并使用GO生物学聚集解析，证实了银杏叶所涉及的生物学功能与过程，包括受体配体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合、生长因子受体结合、DNA结合转录激活剂活性RNA聚合酶II特异性、蛋白酶绑定等功能，这些相应的生物学特性对其在银杏叶治疗失重性心肌萎缩所涉及的作用靶点及其相关通路中都起着重要的作用。

通过KEGG聚集解析，找到可以治疗失重性心肌萎缩的关键基因，其中有MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、内分泌耐药等其他信号通路。PI3K/Akt及HIF-1信号通路在心肌细胞缺血、缺氧中起着重要的调控作用，主要参与细胞的增殖、凋亡及氧化应激反应；研究发现MAPK信号通路在心肌炎症、心肌细胞损伤中起着重要的调控作用，参与心肌细胞的增殖、分化。研究表明，在失重性心肌萎缩中，多种细胞因子与细胞通路被激活，PI3K/Akt通路[32]、NF-κB信号通路[33]等均是较为经典的参与失重性心肌萎缩相关的通路。

通过上面的实验结果，我们可以得出结论：运用网络药理学分析的方法，在银杏叶中发现其治疗失重性心肌萎缩的关键靶点涉及MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、内分泌耐药、NF-κB信号通路等其他信号通路，与目前实验研究证实的失重性心肌萎缩的发病机制涉及的信号通路部分一致，且通过分析发现银杏叶还可通过其他成分、靶点、通路对失重性心肌萎缩起治疗作用。研究结果显示，银杏叶主要的活性成分对AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、IL-1β、JUN、CXCL8、EGF、FOS、MAPK14等参与失重性心肌萎缩的相关分子起着重要的调控作用，而这些分子主要参与细胞的分化、增殖、凋亡调控。因此，采用网络药理学技术探究银杏叶对模拟失重/失重条件下的心肌细胞萎缩的机制具有重要的意义。采用网络药理学方法可以为后续实验研究和分析，以及优化实验提供重要的基础。不足点是网络药理学研究主要通过计算机大数据分析状况下虚拟计算完成的，其结果的准确性也常常受到质疑，故后续拟结合实验来进一步观察银杏叶防治失重性心肌萎缩的药效功能及验证银杏叶防治失重性心肌萎缩的药理学机制。