响应面优化超声辅助提取莲房中色素的工艺研究

范培

（衡水学院，河北 衡水 053000）

莲房是莲蓬取出莲子后的废弃物，以此为原料可以提取出一系列天然色素混合物。这些天然色素主要是原青花素，原花青素是一类多酚化合物的总称，是由多种儿茶素或表儿茶素组成的混合物。原花青素是目前国际上认为最有效清除自由基的纯天然抗氧化剂之一，其抗氧化性能是其他维生素类的几十倍，因此具有很好的研究价值[1-3]。原花青素普遍存在于植物细胞中，其清除自由基的性能适合应用于食品、药品的生产制作中。

莲在我国的种植历史很长，其生成的莲子既可入药也可食用，广受人民群众喜爱，但是莲的花托——莲房一般都被丢弃。干燥的莲房质量很轻，质地疏松多孔，内部多呈裂隙状如海绵，颜色呈棕色[4]。莲房中含有的各种活性物质可入药，具有止血、化瘀、祛湿的功效[5]。而原花青素是莲房中的主要活性成分之一。

目前关于莲房中提取色素的研究还处于初级阶段，主要的研究都在其药用价值上。根据现有文献报道，莲房中提取色素的方法有微波辅助丙酮提取法[6]、脉冲超声辅助提取法[7]和双酶辅助乙醇提取法[8]等，对于用乙醇作为提取剂进行提取并结合超声辅助提取用响应面优化法进行工艺优化的相关报道比较少。因此本研究主要是从这方面进行实验设计和操作，为后期莲房中提取色素并进行工业化生产提供了一定的参考依据。

实验设计采用的是Box-Behnken实验设计原理，而实验所得各项结果采用Design Expert 11软件进行处理分析。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

莲房，河北省衡水市衡水湖，采摘完整无变色的优质莲蓬，去莲子，用蒸馏水清洗后撕成细条状，60℃下烘干至质量恒定，粉碎，过60目筛，避光密闭保存备用；无水甲醇、无水乙醇、浓硫酸、香草醛，所有试剂均为分析纯。

TU-1800 紫外可见分光光度计；恒温水浴锅；TH-600BQ 超声波清洗机；800A 研磨粉碎机；FA2004 电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 实验前期准备工作

用量筒准确量取400 mL 无水乙醇转移至500 mL的容量瓶中，加蒸馏水至刻度摇匀，配制成80%体积浓度的乙醇水溶液备用。其余20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%不同体积浓度的乙醇水溶液按照同样的方法配制好备用。再量取30 mL 浓硫酸并加入到蒸馏水中定容至100 mL 摇匀，得到体积浓度为30%的硫酸溶液备用。用电子天平准确称取30 g香草醛固体，溶解至1 L 的甲醇液体中，配制成30 g/L 的香草醛甲醇溶液。所有配制液体均放置于避光处保存备用。

1.2.2 实验色素提取

准确称取0.200 g 的干燥莲房粉末于锥形瓶中，用配制好的某一体积浓度乙醇水溶液浸泡，此时在恒定温度下用超声波清洗机超声一定时间，然后将锥形瓶中的混合液体离心分离，提取上清液定容后再进行硫酸-香草醛法[9]显色处理，然后在预热好的分光光度计中进行吸光度测定。

1.2.3 实验吸光度测定

先将离心分离后的提取液定容后，再利用硫酸-香草醛法将配制好的溶液混合，并在温度为30℃的条件下进行20 min 的避光显色处理，然后将溶液放于1 cm 的比色皿中，在波长500 nm 条件下用紫外可见分光光度计进行吸光度测定。空白液的制备过程与试样相同，但不加入提取液。

1.2.4 单因素实验设计

单因素实验过程中需先在根据大量文献资料总结所选取的几个单因素范围内分别进行实验条件的摸索，并测定试样的吸光度值，最后确定各单因素实验的变化趋势及最优条件，确定其中几个对实验结果影响较大的单因素进行实验设计，为实验设计提供合理范围。根据已有的科学研究基础选取出超声提取温度、超声提取时间、乙醇浓度、液料比和超声功率等几个因素进行实验。其中结合所查文献经单因素实验，摸索得到超声提取温度实验范围为25℃～50℃，超声提取时间实验范围为5～20 min，乙醇浓度实验范围为20%～100%，液料比实验范围为25∶1～125∶1，超声功率实验范围为300～800 W。

1.2.5 响应面实验设计

根据前期单因素实验所得结果作为实验设计的基础，本实验根据Box-Behnken 实验设计原理，在几组单因素实验的基础上，选取对莲房中色素提取效果影响比较大的超声提取温度、超声提取时间、乙醇浓度、液料比四个因素，采用四因素三水平的响应面分析法进行设计，其具体因素水平数据如表1。根据实验设计表中所示，需要按照不同的实验条件再次进行实验，测定一系列吸光度值，并将所得结果用Design Expert 11 软件进行处理分析。

表1 响应面实验因素水平设计表

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

本实验的几组单因素实验部分分别从超声提取温度、超声提取时间、乙醇浓度、液料比和超声功率五个因素进行实验考查选择合理范围，选取事先从大量文献中查得的实验范围，对吸光度值及其对应的考查因素进行绘图并分析实验结果，进而选取合适的各单因素实验范围，再进行实验设计、检测和数据处理。

2.1.1 超声提取时间对提取效果的影响

由图1可知，超声提取时间对从莲房中提取色素的效果有较大的影响。实验中选取超声提取时间的范围为5～60 min，但经过实验并分析实验结果后可知，一旦超声时间超过25 min，提取液经测定其吸光度值变化不大，并且溶液出现颜色上的变化，应该是提取时间过长，造成莲房中大量其他物质被溶出而影响了实验效果，因此提取时间不易过长。经吸光度值-超声提取时间绘图，峰值出现在10～15 min，为后期实验设计提供了合理的取值范围。

图1 超声提取时间对提取效果的影响

2.1.2 超声提取温度对提取效果的影响

由图2可知，超声提取温度对从莲房中提取色素的效果也有较大影响。实验中预设的提取温度范围为25℃～90℃，经实验检测并分析结果表明，温度过高会引起溶出杂质多，并且吸光度值不再有明显的变化，说明温度过高不利于提取的顺利进行，因此将温度控制在25℃～50℃。在图2中可直观看到，吸光度值-超声提取温度的峰值出现在温度为30℃左右时，吸光度值达到高点，可视为在此条件下出现了提取的最优效果，由此确定了响应面法设计实验的超声提取温度取值范围。

图2 超声提取温度对提取效果的影响

2.1.3 料液比对提取效果的影响

由图3可知，料液比对从莲房中提取色素的效果影响比较大。实验过程是选取了料液比的范围为5∶1～150∶1，通过实验结果分析，吸光度-料液比的峰值出现在当料液比在50∶1 左右时，可视为达到了最佳提取效果，由此可确定响应面法设计实验的料液比取值范围。

图3 料液比对提取效果的影响

2.1.4 乙醇浓度对提取效果的影响

由图4 可知，乙醇浓度对色素提取效果影响较大。实验过程中当乙醇浓度由低到高变化时，提取效果变化较大，当吸光度值-乙醇浓度的曲线峰值出现在浓度达到50%左右时，此时吸光度值达到最高，提取效果最佳。由此可确定，乙醇浓度为响应面法设计实验的重要影响因素之一，其取值范围也可确定下来。

图4 乙醇浓度对提取效果的影响

2.1.5 超声提取功率对提取效果的影响

经单因素实验表明，在提取过程中超声功率范围在300～800 W之间时，由实验提取液定容显色后测得的吸光度值变化不大，所得吸光度值-超声功率曲线趋于水平趋势，可视为超声功率变化对提取效果的影响不大，在后面进行响应面法设计实验时其影响可忽略不计。

因此，在接下来的实验设计中，只选取单因素实验中的超声提取时间、超声提取温度、料液比和乙醇浓度四个因素，并把四个因素的变化考查范围进行了确定。

2.2 响应面实验设计及结果分析

2.2.1 响应面实验设计

以选择的几组单因素实验结果为依据，用Design Expert 11 软件的Box-Behnken 实验设计方案进行实验设计，可知后续实验共需制备27个试样，并将检测吸光度值作为响应面实验设计结果，后期进行数据分析，具体设计结果如表2所示。

表2 超声提取莲房色素响应面实验数据处理结果

2.2.2 响应面设计双因素影响结果分析

图5 各因素交互作用对莲房中色素提取的影响

由图5（a～f）可知，实验设计所选取的四个考查因素对于提取莲房中的色素都有很大的影响。其中由图5（a、b、f）中几个双因素交互作用效果图可知，图中所显示的等高线呈现椭圆形，说明料液比、超声提取时间对提取效果的影响更为显著一些。随着超声提取时间、料液比、超声提取温度、乙醇浓度数值的逐渐增加，表示色素提取效果的吸光度值呈现由低到高再逐渐降低的趋势，吸光度值变化比较明显，进而使整体曲面的变化效果比较明显，能够显示出这几个因素对提取色素的效果影响比较大，是进行实验的四个重要考查因素，其中对实验效果的影响规律：料液比＞超声提取时间＞超声提取温度＞乙醇浓度。

3 结论

在本次衡水湖产莲房中提取色素的实验研究过程中，以单因素实验为基础，通过响应面法组合设计实验条件进行实验测定吸光度值，整合实验数据，用Design Expert 11软件分析出从莲房中提取色素的最优条件，及各因素对实验结果的影响大小。经分析软件处理结果图可知，提取莲房中色素的最优条件：超声提取温度37.5℃，超声提取时间12.5 min，料液比75∶1，乙醇浓度60%。经过对实验结果图的处理分析可知，在以上最佳提取条件下进行色素提取，可以达到最理想的提取效果，其中对提取效果影响最大的因素是料液比，其次为超声提取时间、超声提取温度、乙醇浓度。

本实验研究的目的是通过实验得到可靠的实验数据，再通过Design Expert 11软件进行结果分析，找到几个对从莲房中提取色素影响较大的几个因素，并确定最优条件，为后期提取天然色素的实验方法和实验条件提供依据，为提高衡水湖产莲房的利用率，进而提高其经济效益提供参考。