两种幽门螺杆菌检测方法的临床比较

谭翠 王楠方 吕国恩

529500江门市中心医院窥镜中心，广东江门

幽门螺杆菌(HP)是微需氧菌，革兰染色阴性。HP 的感染流行率与年龄、地区、种族和社会经济状况相关[1]。HP感染与消化系统相关疾病密切相关，故第五次全国HP 感染处理共识提出，凡是HP 阳性患者均需要进行HP 根除治疗[2]。检测患者是否有HP 感染对患者的治疗有指导意义。目前临床上有多种针对HP 检测的方法，不同检测方法的特异性也有所差异，目前诊断HP感染的检测方法分为侵入性同非侵入性两大类，常见侵入性方法有病理组织法、胃黏膜组织聚合酶链反应(qPCR)、细菌培养、细菌涂片等；非侵入方法有血清抗体检测、胃液快速尿素酶法、13C、14C呼气试验；研究表明，HP 感染数周后方可在血中发现特异抗体，因此血清抗体检测HP 阴性不能作为除外感染，在HP 根除后血清中抗体仍可维持＞6 个月，血清抗体检测HP 阳性不能作为现症感染的证据[3]。有文献报告，在13C尿素呼气试验中，少量的HP可能使呼出13CO2达不到阈值而产生假阴性结果，与快速尿素酶法一样，其检查结果亦受患者服用抗生素以及抑酸剂的影响[4]。另外，非侵入性检测方法亦不能对患者胃黏膜病变程度以及治疗效果作出有效评估，因此，侵入性胃镜检查对于诊断HP 感染仍有必要。本文以组织病理学检测法为“金标准”，对胃黏膜组织的qPCR 检测侵入性方法与非侵入性快速尿素酶检测两种方法进行对比分析，检测其各自敏感性与特异性，评价两者应用价值。

资料与方法

选取2020年5-9月因上腹部不适在江门市中心医院进行胃镜检查的患者92 例，男44 例，女48 例；年龄23～78岁，平均50.19岁；慢性胃炎63例，十二指肠球炎11 例，胆汁反流性胃炎5 例，消化性溃疡11例，胃癌术后2例。

纳入标准：①所有患者均因上腹部不适而行胃镜检查；②近4 周内未服用抗生素、抑酸剂等影响HP检测结果的药物；③无HP 根除治疗史，无胃肠部手术史；④患者均已经签署知情同意书。

排除标准：①心肺功能差，不能耐受胃镜检查；②合并幽门梗阻、上消化道出血等影响HP 检测结果的疾病；③心、肝、肾严重疾病者；④治疗不配合者。

方法：患者检查当天空腹10 h 由同一医生行胃镜检查，于胃窦部取小块胃黏膜组织用于检查。胃黏膜组织qPCR 法：通过美国国家生物技术信息中心GenBank数据库数据，以胃幽门螺杆菌ureC基因作为HP 检测靶标，以人类看家基因ACTB 作为荧光检测的内对照，分别设计特异性引物、探针，由生物公司合成。胃黏膜组织通过组织DNA 提取试剂盒提取DNA，并置于-80℃冰箱保存。在荧光扩增反应中，每个样本均做3 个重复，每管20 μL 反应体系包括10 μL 2×GoldStar Probe Mixture，10 μM引物HP-F、HPR、ACTB-F、ACTB-R 各0.5 μL，10 μm 探针HP-P、ACTB-P 各1 μL，2 μL核酸模板及适量的水。配好反应液置于ABI 7500 荧光定量PCR 仪(ThermoFisher)中进行扩增，设置扩增条件95℃，15 s；56℃，30 s；65℃，40 s并收集荧光，扩增40个循环。引物探针序列，见表1。

表1 物探针序列

胃黏膜组织病理检测法：胃镜下钳取胃窦部组织，于10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE 染色，染色结果由2 位病理医生同时阅片作出病理诊断。快速尿素酶法：取胃液样本2滴加入离心管中，将盖盖紧，振摇30 s，并静置2 min，使溶液和盖上的酚红试纸接触，接触后与色卡对比观察结果，一般在3 min 内出现颜色变化，试纸由黄色变成红/紫红色，即为阳性，颜色未变为阴性。

观察项目：根据提取的数据，导出2×2 个应急表，以确定敏感性、特异性。所有统计数据都以其95%置信区间(95%CI)作为绝对值报告。灵敏度和特异性分别根据公式TP(真阳性)/TP+FN(假阴性)和TN(真阴性)/TN+FP(假阳性)计算。

统计学方法：采用SPSS 18.0 统计学分析系统展开数据处理；计数资料用[n(%)]表示，采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

不同检测方法的阳性率比较：以组织病理HP 结果作为诊断金标准，qPCR 的阳性率与组织病理学检查比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；尿素酶试验的阳性率高于组织病理学检查和qPCR，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 不同检测方法的阳性率比较[n(%)]

不同检测方法的检出结果比较：92 例患者中，组织病理学检查的阳性例数为14，阴性例数为78。qPCR 检查的阳性例数为16，阴性例数为76。尿素酶试验检查的阳性例数为59，阴性例数为33。

不同检测方法的敏感性与特异性比较：qPCR 的敏感性与尿素酶试验比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；qPCR 的特异性高于尿素酶试验，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 不同检测方法的敏感性与特异性比较[n(%)]

讨论

HP 是一种常见的胃上皮细胞感染，与胃、十二指肠酸性消化性疾病、胃肿瘤及胃肠道以外的疾病也相关。流行病学调查显示，全世界人群HP 的感染率在59.2%左右，其中有症状的在15%～20%[5]。HP 在全世界各个年龄段的人群中均有发现，HP 的治疗非常必要，而准确诊断HP 是治疗HP 感染的关键。本研究以组织病理学检测结果作为“金标准”，用快速尿素酶检测与qPCR 分子检测两种方法对比，研究结果显示，qPCR 检测法的敏感性与特异性均优于快速尿素酶检测法。

快速尿素酶检测法是通过检测HP 产生的尿素酶将尿素分解成氨和二氧化碳，其中氨可使周围介质pH值升高，使试剂变色，取胃液标本检测，具有简单、快速、无创、便宜的优点。但应用质子泵抑制剂、抗生素和铋剂进行治疗后可能导致假阴性结果[6]。胃内存在其他产脲酶细菌，如头孢葡萄球菌也可能导致假阳性结果。

PCR用于细菌检测，还可用于广谱感染检测、新发感染评估、细菌基因型鉴定、抗生素耐药性和流行病学研究，PCR反应成功的关键是准确的引物设计和正确的基因选择[7-8]。本研究用ureC 基因作为HP 检测靶标，ureC 可用于扩增HP 基因组，≥2 个的靶基因扩增以提高HP 的特异性，从而使HP 的诊断减少假阳性；以人类看家基因ACTB 作为荧光检测的内对照，分别设计特异性引物、探针，由生物公司合成。qPCR 检测方法不依赖于形态识别，所以不会因质子泵抑制剂、铋剂、抗生素等药物导致假阴性，不存在个体偏倚，可快速、准确、高效、自动化检测HP。

qPCR 和尿素酶试验的敏感性相当，均能有效检出HP 感染，但qPCR 检测法的特异性高于快速尿素酶检测法，并且qPCR 检测法不受药物影响，保证了胃肠道疾病中抗生素及抑酸剂等药物的应用。