载脂蛋白E基因多态性与蛛网膜下腔出血相关性的Meta分析▲

刘 军 吴 刚 黄 玮

(1 广西柳州市人民医院神经外科，柳州市 545000，电子邮箱：305302887@qq.com；2 广西医科大学第一附属医院神经外科，南宁市 530021)

神经系统疾病特别是中枢神经系统疾病是多因多果的复杂疾病，近年来其发病率逐渐升高，备受关注[1-2]。家系研究表明，有家族史的人群发生脑血管疾病的风险显著增高[3]；同卵双生子同时发生脑卒中的概率是异卵双生子的5倍[4]。这提示遗传因素在脑血管疾病的发生中具有重要作用。大量基因组学研究表明，北高加索人群和亚洲人群在脑梗死的遗传易感性方面存在显著差异[5-7]，但在脑出血易感基因方面的研究证据还不足。目前认为，载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因多态性在蛛网膜下腔出血的发生和发展过程中起重要作用。但由于实验设计方法不同，样本量大小不一，结论仍然备受争议。为了阐明ApoE基因多态性与脑出血之间的关系，以及北高加索人群与亚洲人群之间该基因多态性的差异，本研究拟通过对已发表的ApoE基因多态性与蛛网膜下腔出血的相关研究进行Meta分析，以期获得较为客观的结论。

1 材料与方法

1.1 检索策略 以subarachnoid hemorrhage、apolipoprotein E、APOE、polymorphism、mutation、variant为英文检索词，组合检索PubMed、Web of Science、Embase和Cochrane Library数据库。以“蛛网膜下腔出血”“载脂蛋白E”和“多态性”为中文检索词，组合检索中国知网(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)和万方数据库。检索时间为1990年1月1日至2019年2月20日。文种语言仅限于中文和英文。同时手工检索纳入文献的参考文献。

1.2 文献的纳入标准和排除标准

1.2.1 纳入标准：(1)文献的研究类型为病例对照研究；(2)文献研究对象分为病例组和对照组，病例组为明确诊断为蛛网膜下腔出血的患者，对照组为正常人群；(3)暴露因素为ApoE基因多态性；(4)结局指标为蛛网膜下腔出血发病风险。

1.2.2 排除标准：(1)重复发表的文献，只纳入最近的1篇；(2)未提供基因型分布情况和主要结局等数据；(3)病例组或对照组样本数较少(<30例)；(4)遗传家系；(5)学位论文、会议摘要、综述，动物实验等；(6)非中文或英文文献；(7)基因型分布频率不符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)定律。

1.3 文献筛选和偏倚风险评价 由2名文献评价员独立筛选文献、提取资料并进行核对，然后使用纽卡斯尔-渥太华量表(Newcastle-Ottawa Scale,NOS)[8]对纳入的文献进行偏倚风险评价，任一步骤意见不统一时均讨论解决。NOS评分≥6分视为纳入文献的质量较好。

1.4 数据提取 资料提取的内容包括发表时间、作者、研究实施的国家、人群，病例组和对照组的样本量，ApoE基因各等位基因和基因型分布频率等。ApoE基因是由3个等位基因(ε2、ε3、ε4)构成，共有6种基因型(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)，其中ε3/3为野生型，ε2/2、ε4/4为纯合突变型，ε2/3、ε2/4、ε3/4为杂合突变。本文以ε3(ε3/3)为参考，运用以下8个模型分析ApoE基因ε2、ε4等位基因多态性与蛛网膜下腔出血易感性的关系。(1)ε2显性模型(ε2/2+ε2/3+ε2/4和ε3/3)；(2)ε2等位基因模型(ε2和ε3)； (3)ε4显性模型(ε2/4+ε3/4+ε4/4和ε3/3)；(4)ε4等位基因模型(ε4和ε3)；(5)ε2/2纯合子模型(ε2/2和ε3/3)； (6)ε4/4纯合子模型(ε4/4和ε3/3)；(7)ε2隐性模型(ε2/2和ε2/3+ε2/4+ε3/3)；(8)ε4隐性模型(ε4/4和ε2/4+ε3/4+ε3/3)。

1.5 统计学分析 采用比值比(odds ratio,OR)及其95%CI评价ApoE基因多态性与蛛网膜下腔出血易感性的关联强度。对纳入文献的对照组基因型分布频率进行χ2检验，判断其是否符合HWE定律，P>0.05则认为符合HWE定律，说明样本具有群体代表性。采用Q检验和I2检验分析各研究之间的异质性：若P>0.1或I2≤50%，说明各研究之间没有明显异质性，采用固定效应模型进行合并分析；反之则采用随机效应模型进行合并分析；采用敏感性分析评估合并结果的稳定性和可靠性。采用Egger直线回归法检验发表偏倚，若P>0.05，提示发表偏倚不显著，并绘制漏斗图。使用R软件的GWASExact HW程序包计算[9]HWE，通过Review Manager 5.3建立森林图，采用Stata 15.0软件进行其余的分析。Meta分析的结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 文献检索结果 共检索到相关文献218篇，经过纳入标准和排除标准逐层筛选，最终纳入7篇文献[10-16](Fayed等[17]的研究因纳入样本数太少被排除，Kokubo等[18]和Suvatha等[19]的研究因不满足HWE定律被排除)。检索和筛选流程见图1。

图1 文献检索和筛选流程图

2.2 纳入研究的基本特征及偏倚风险评价结果 纳入的7篇文献中有4篇[10，13-15]对北高加索人群进行分析，有3篇[11-12，16]对亚洲人群进行分析；纳入分析的病例组852例，对照组1 420例。χ2检验结果均显示P>0.05 ，提示基因型分布频率均符合HWE定律。偏倚风险评价结果示，1篇文献的NOS评分为6分[10]，2篇的NOS评分为7分[11-12]，其余4篇文献的NOS评分为8分[13-16]，提示纳入文献的质量较好。纳入研究的基本特征及偏倚风险评价结果见表1。

表1 纳入研究的基本特征及偏倚风险评价结果

2.3 ε2显性模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε2显性模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=37%，P=0.14)，采用固定效应模型进行合并分析；结果显示，ε2显性模型没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=1.07，95%CI：0.83,1.37；P=0.60)。亚组分析结果显示，ε2显性模型对亚洲人群及北高加索人群蛛网膜下腔出血的易感性均无显著影响(均P>0.05)。漏斗图基本对称，Egger检验结果显示P=0.504，提示没有明显的发表偏倚。敏感性分析提示结果可靠。见图2。

图2 ε2显性模型分析结果

2.4 ε4显性模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε4显性模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=29%，P=0.21)，采用固定效应模型进行合并分析；结果显示，ε4显性模型没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=1.03，95%CI：0.83，1.28；P=0.79)。亚组分析结果显示，ε4显性模型对亚洲人群与北高加索人群蛛网膜下腔出血的易感性均无显著影响(均P>0.05)。漏斗图基本对称，Egger检验结果显示P=0.702，提示纳入的研究没有明显的发表偏倚。敏感性分析提示结果可靠。见图3。

图3 ε4显性模型分析结果

2.5 ε2等位基因模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε2等位基因模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=42%，P=0.11)，采用固定效应模型进行合并分析；结果显示，与ε3等位基因相比，ε2等位基因没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=1.10,95%CI:0.88，1.38；P=0.41)。亚组分析结果显示，ε2等位基因模型对亚洲人群与北高加索人蛛网膜下腔出血的易感性均无显著影响(均P>0.05)。漏斗图基本对称，Egger检验结果显示P=0.237，提示没有明显的发表偏倚。敏感性分析提示结果可靠。见图4。

图4 ε2等位基因模型分析结果

2.6 ε4等位基因模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε4等位基因模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=40%，P=0.12)，采用固定效应模型进行合并分析，结果显示，与ε3等位基因相比，ε4等位基因没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=1.04，95%CI：0.86，1.25；P=0.71)。亚组分析结果显示，ε4等位基因模型对亚洲人群与北高加索人蛛网膜下腔出血的易感性均无显著影响(均P>0.05)。漏斗图基本对称，Egger检验结果显示P=0.697，提示没有明显的发表偏倚。敏感性分析提示结果可靠。见图5。

图5 ε4 等位基因模型分析结果

2.7 ε2/2纯合子模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε2/2纯合子模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=0%，P=0.44)，采用固定效应模型进行合并分析；结果显示以ε3/3基因型为对照，ε2纯合子突变没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=1.74，95%CI：0.76，3.97；P=0.19)。亚组分析结果显示，ε2/2 纯合子突变增加了北高加索人蛛网膜下腔出血的易感性(OR=3.27，95%CI：1.08，9.88；P=0.04)，而对亚洲人群蛛网膜下腔出血的易感性无显著影响(OR=0.72，95%CI：0.18，2.80；P=0.63)。漏斗图基本对称，Egger检验结果显示P=0.504，提示各研究没有明显的发表偏倚。敏感性分析结果提示，移除文献[13]后对分析结果影响较大，结果有待进一步证实。见图6。

图6 ε2/2纯合子模型分析结果

2.8 ε4/4纯合子模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε4/4纯合子模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=0%，P=0.71)，采用固定效应模型进行合并分析；结果显示，以ε3/3为对照，ε4/4纯合子突变没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=1.00,95%CI：0.52，1.92；P=0.99)。亚组分析结果显示，ε4/4纯合子突变模型对亚洲人群和北高加索人群蛛网膜下腔出血的易感性无显著影响(均P>0.05)。漏斗图基本对称，Egger检验结果显示P=0.504，提示没有明显的发表偏倚。敏感性分析提示结果可靠。见图7。

图7 ε4/4纯合子模型分析结果

2.9 ε2 隐性模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε2隐性模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=0%，P=0.43)，采用固定效应模型进行合并分析；结果显示：ε2 隐性模型没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=1.73，95%CI：0.76，3.95；P=0.19)。亚组分析结果显示，ε2 隐性模型增加了北高加索人蛛网膜下腔出血的易感性(OR=3.37，95%CI：1.12，10.19；P=0.03)，而对亚洲人群无显著影响(OR=0.69，95%CI：0.18，2.69；P=0.60)。漏斗图基本对称，Egger检验分析结果显示P=0.213，提示没有明显的发表偏倚。敏感性分析结果提示移除文献[13]后对分析结果影响较大，结果有待进一步证实。见图8。

图8 ε2 隐性模型分析结果

2.10 ε4 隐性模型分析结果 7篇文献[10-16]均分析了ε4隐性模型，各研究之间不存在明显的异质性(I2=0%，P=0.79)，采用固定效应模型进行合并分析；结果显示，ε4隐性模型没有增加蛛网膜下腔出血的易感性(OR=0.98，95%CI：0.51，1.89；P=0.96)。亚组分析结果显示，ε4隐性模型对亚洲人群与北高加索人群蛛网膜下腔出血的易感性无显著影响(均P>0.05)。漏斗图基本对称，Egger检验分析结果显示P=0.615，提示没有明显的发表偏倚。敏感性分析提示结果可靠。见图9。

图9 ε4 隐性模型分析结果

3 讨 论

ApoE基因位于人类基因的第19号染色体上，全长3.7 kb，含有4个外显子。ApoE基因突变较为常见[20]。ApoE ε2等位基因的112位点和158位点均是半胱氨酸，ApoE ε3等位基因的112位点是半胱氨酸，而158位点是精氨酸，ApoE ε4等位基因的112位点和158位点均是精氨酸。因此，ApoE等位基因分布频率不同决定了不同人群中ApoE基因表型的差异。研究表明，ApoE基因的多态性与颅内出血有一定的相关性，但颅内不同部位的出血可能存在差异[12]。其中最值得关注的是ApoE ε4等位基因。研究显示，脑叶的出血多与携带ApoE ε4等位基因及血管内β淀粉样蛋白酶沉积有关[21-22]。一项针对基因多态性与脑出血之间相关性的Meta分析结果提示，携带ApoE ε4等位基因与脑出血之间存在关联，而携带ApoE ε2等位基因与脑出血之间并无相关性[23]。Maxwell等[24]的Meta分析结果显示，ApoE ε4等位基因与脑叶微出血(脑实质内部出血)的相关程度较高，同时ApoE ε4等位基因与血管淀粉样变相关，由此推测脑叶微出血可以作为血管淀粉样变所致脑出血的标志。然而，与脑叶出血不同的是，80%的蛛网膜下腔出血是由于颅内动脉瘤破裂所致[25]。这或为本研究中ApoE ε4等位基因突变并没有增加北高加索人和亚洲人蛛网膜下腔出血易感性的原因之一。本研究结果显示，ApoE基因的ε2纯合子突变增加了北高加索人蛛网膜下腔出血的易感性，而对亚洲人群无显著影响；ApoE ε2隐性模型也增加了北高加索人群蛛网膜下腔出血的易感性，而对亚洲人群蛛网膜下腔出血的易感性无显著影响。这提示ApoE ε2纯合子突变和隐性模型对北高加索人群和亚洲人群蛛网膜下腔出血易感性的影响存在差异。同时，这一结果也提示，除了ApoE基因之外，不同人群之间蛛网膜下腔出血相关基因可能存在差异，这或与环境因素有关。然而，传统的遗传关联研究，往往只能发现常见变异的相关位点，而不能进一步探索未知的位点。这可能会遗漏有阳性关联甚至效应较大的未知基因位点。随着全基因组测序等高通量基因分型平台的建立及国际人类基因图谱的完成，全基因组关联分析越来越受到科学家的关注，将来可能会发现更多的脑出血相关基因位点。

本研究采用Meta分析的统计学方法，制定了严格的文献纳入标准和排除标准，将ApoE基因多态性与蛛网膜下腔出血的相关研究进行了系统评价和量化。结果显示，本研究纳入文献的基因型分布频率均符合HWE定律，提示研究人群具有代表性，结果可靠。此外，本研究应用固定效应模型进行总体效应值的估计，经Egger直线回归和漏斗图检验发表偏倚，结果均提示各研究间不存在发表偏倚，因而判断结果较准确。但本研究方法也存在一定的不足：首先，纳入Meta分析的研究样本量比较有限，证据强度稍低；其次，纳入分析的研究大多数为原始研究，均没有对蛛网膜下腔出血的解剖学因素进行筛选，因此可能无法完全排除血管畸形等血管结构异常所致的出血性患者。

综上所述，ApoE基因的ε2纯合子突变和隐性模型与北高加索人群蛛网膜下腔出血易感性相关，但对亚洲人群蛛网膜下腔易感性无明显影响。应注意识别不同人群间ApoE基因的突变情况，预测蛛网膜下腔出血，并给予早期干预提供科学依据。