大孔树脂纯化细毡毛忍冬中总黄酮工艺研究

郑光雅

四川省监狱管理局中心医院，四川 成都 610000

细毡毛忍冬LonicerasimilesHemsl(图1、图2)为西南地区金银花的主流品种[1]，该种资源丰富，使用历史悠久。大量研究表明，金银花及其同属植物的化学成分以有机酸、黄酮类、皂苷类成分为主，但细毡毛忍冬相关研究鲜见报道。近年来国内外新发展的分离技术大孔吸附树脂在医药领域特别是天然药物精制中广泛应用，是提取分离中草药有效成分的一种有效方法[2-3]。本文以细毡毛忍冬提取物为研究对象，采用大孔树脂对其黄酮类成分进行分离、纯化研究，为细毡毛忍冬化学成分的进一步深入研究奠定基础。

图1 细毡毛忍冬原植物

图2 细毡毛忍冬干药材图

1 仪器与材料

1.1 仪器 旋转蒸发仪RE-5203(上海亚荣生化仪器厂)；紫外-可见分光光度计UV1100(上海天美科技有限公司)；电子天平TD6001(天津天与仪器厂)；大孔树脂D101(天津市光复精细化工研究所)。

1.2 材料 芦丁标准品(中国药品生物制品检验所)；大孔树脂D101、DM301、DA201、AB-8(均为天津农药股份有限公司树脂分公司)，LD605(为晨光化工研究院)；乙醇、亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液、氢氧化钠等均为分析纯。

细毡毛忍冬药材采购于四川省南江县，经成都中医药大学马逾英教授鉴定为忍冬科植物细毡毛忍冬LonicerasimilisHemsl。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品约25 mg，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，摇匀。精密量取20 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取细毡毛忍冬干燥花蕾475 g，采用文献[4-5]方法进行提取得浸膏。精密称取浸膏0.5 g，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 标准曲线的建立 精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，亚硝酸钠-硝酸铝显色。再加水定容至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法[6]，于510 nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程：A=0.0137C+0.0008，r=0.9999，n=6。线性范围：8.0179～48.1074 μg/mL。

2.1.4 细毡毛忍冬提取物中总黄酮的测定 取供试品溶液适量，参照2.1.3中方法测定其吸光度，代入标准曲线，计算出总黄酮的含量。

2.2 筛选不同型号大孔吸附树脂的研究

2.2.1 大孔树脂的预处理 试验用5种大孔树脂(D101、DM301、DA201、AB-8、LD605)用体积分数95%的乙醇浸泡24 h，再用蒸馏水反复洗涤6～8次，至无乙醇味，然后用5%HC1溶液浸泡8 h，用蒸馏水洗至中性，再用5%的NaOH溶液浸泡8 h，用蒸馏水洗至中性，备用。

2.2.2 不同类型大孔树脂吸附性能的考察 量取各种类型的大孔树脂(干重约为1 g)置150 mL的具塞锥形瓶中，分别精密加入细毡毛忍冬供试品溶液90 mL，静置24 h，时时振摇，使其充分吸附后，过滤，按照2.1.3中的方法测定滤液中剩余总黄酮的含量，计算吸附量；将吸附平衡后的大孔树脂转移至锥形瓶中，用95%乙醇解吸，测定解吸液中总黄酮的含量，计算解析率；结果见表1、图3。

图3 不同类型大孔树脂静态吸附性能分析图

表1 各型树脂对细毡毛忍冬总黄酮的吸附率和解吸率

吸附量=上柱液中总黄酮含量(mg)-泄漏液中总黄酮含量(mg)

吸附率=[吸附量(mg)/上柱液中总黄酮含量(mg)]×100%

解吸率(%)=[解吸液中总黄酮含量(mg)/吸附量(mg)]×100%

结果表明：通过对五种不同的大孔树脂进行考察，发现 LD605 吸附能力最强，但是很难被解吸下来；D101大孔树脂在所给的实验条件下对总黄酮吸附有较大的吸附量，而且能够把绝大部分解吸下来。故选择D101大孔树脂纯化细毡毛忍冬提取物。

2.3 D101大孔树脂纯化细毡毛忍冬中总黄酮的的工艺参数考察

2.3.1 上柱液浓度对总黄酮含量的影响 称取一定量的细毡毛忍冬浸膏，分别稀释成不同浓度，通过装有D101大孔树脂(干重约4g)的吸咐柱中，以2～3 mL/min 流速进行吸附，收集流出液，测定总黄酮的含量，计算大孔树脂的比吸附量，结果见表2、图4。

图4 上样液浓度考察结果图

表2 上样液浓度考察

比吸附量=吸附量(mg)/树脂干重(g)

结果表明:上柱液生药浓度为0.10 g/mL时，D101大孔树脂对细毡毛忍冬总黄酮的比吸附量最大，为97.55 mg/g，因此选择上柱液生药浓度为0.10 g/mL。

2.3.2 比上柱量对总黄酮含量的影响 将180 mL的细毡毛忍冬提取液通过D101大孔树脂(干重约4 g)，上柱分离纯化，分段收集流出液，每份10 mL。测定流出液中总黄酮的含量，计算出其泄漏百分率，结果见表3、图5。

图5 吸附泄漏曲线图

表3 比上柱量的考察

续表 表3 比上柱量的考察

比上样量=生药量(g)/树脂干重(g)

结果表明：上样至第14份时泄漏的细毡毛忍冬总黄酮开始显著增大，说明树脂柱开始不能完全吸附药液中的总黄酮。为了细毡毛忍冬总黄酮保留完全，将最大上样量80%的量即110 mL作为上样量，以总黄酮在药材含量为3.39%计，得到树脂的比上柱量为2.74 g/g(药材/干树脂)。

3 结论

大孔吸附树脂为一种有机高聚吸附剂，具有选择性好、吸附容量大、解吸容易、再生简便等优点，对苷类、黄酮类等成分的富集纯化有较好的效果，在生物碱类、酚类等方面的分离纯化中也有广泛应用[7]。鉴于细毡毛忍冬的有效成分有黄酮类和皂苷类成分，本研究采用大孔树脂对细毡毛忍冬的提取物进行分离纯化。大孔树脂法技术条件要求较高，本实验以静态吸附量及解析率筛选树脂类型，在动态吸附条件上，研究影响纯化的工艺参数如上样液浓度、比上柱量等，最终确定了大孔树脂纯化细毡毛忍冬提取物的工艺为：D101大孔树脂纯化细毡毛忍冬提取物，上柱药液生药浓度为0.10 g/mL，比上柱量2.74 g/g(药材/干树脂)上柱吸附。本法简单，成本较低，且能达到较好的分离纯化效果，该法可用于扩大生产，为下一步深入研究细毡毛忍冬中黄酮类化合物奠定了基础。