刺糖多孢菌高产菌株转录组及其多杀菌素合成代谢调控研究

王欣荣 唐智超 曾茂 吕正 翟龙飞 张新宜 刘超兰 褚以文 王克华 黄挺,*

(1 成都大学药学院，抗生素研究与再评价四川省重点实验室，成都 610106；2 华北制药集团爱诺有限责任公司，石家庄 052165)

多杀菌素(spinosad)是一类由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa,S.spinosa)经有氧发酵产生的大环内酯类化合物[1-5]。天然的多杀菌素类化合物的母核由一个12元大环内酯与一个鼠李糖和一个福乐糖胺通过糖苷键相连构成，根据连接的化学基团的差异而将其主要活性成分分为spinosad A和spinosad D[6-7]。多杀菌素具有新颖的作用机制，它以昆虫的神经系统为作用靶标，引起害虫持续的肌肉收缩、颤抖和麻痹，导致害虫瘫痪死亡，因其独特的摄食及触杀毒性，其广泛的作用谱涵盖鳞翅目、缨翅目、双翅目、鞘翅目以及膜翅目等多类害虫[8-10]。多杀菌素兼具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性，作为农用抗生素的杰出代表，有望为我国生物农药产业提供一个新的经济增长点。但多杀菌素的生产开发一直由美国陶氏益农公司和礼来公司所垄断，国内研究起步晚，发展水平和产量较低，推广应用难度大。

本实验室前期通过对刺糖多孢菌进行多轮理化改造，获得一株多杀菌素高产突变株SS-168。分子生物学技术手段的发展成熟为刺糖多孢菌的理性改造提供了更可靠的手段。目前，刺糖多孢菌的全基因组测序工作已全部完成[11]，并阐明了多杀菌素的相关生物合成途径[12-13]。多杀菌素生物合成基因大部分聚集在刺糖多孢菌基因组上约80kb大小的区域中，包含Ⅰ型聚酮合酶的编码基因、鼠李糖转移和修饰基因和福乐糖胺的合成及转移基因。其中负责鼠李糖合成的基因gtt、gdh/kre和epi位于染色体的不同位置[14]。研究表明，通过增加多杀菌素合成相关基因拷贝数，即提高多杀菌素生物合成基因簇内某些基因的表达水平可提高菌株的多杀菌素产量[15]。蔡妹等[16]构建了含有bldD基因和红霉素强启动子(PermE)的重组载体pUC-spn-PermE-bldD和遗传性能稳定的重组菌株S.spinosa-BldD。其结果显示，重组菌株多杀菌素(A+D)产量相比对照菌株提高了1.35倍。了解刺糖多孢菌在发酵过程中各个时期与多杀菌素生物合成直接相关的基因转录水平，并对不同菌株间的差异进行比对分析是刺糖多孢菌的理性改造的重要前提[17]。

本研究通过对刺糖多孢菌野生型菌株SS-WT和高产突变株SS-168在发酵过程中转录本的变化进行分析和对比，发现氨基酸生物合成通路发生了显著变化。通过实时荧光定量PCR验证了甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路中差异基因的表达，并结合发酵发现部分氨基酸的添加能够直接提高多杀菌素产量。这些有趣的结果将为进一步提高刺糖多孢菌的多杀菌素产量提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

刺糖多孢菌(S.spinosa)SS-WT(SSIA-1802)和高产突变株SS-168(ESA-611)由本研究组保藏[18]。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 培养基[18]

(1)种子培养基：玉米淀粉，1%；酵母浸粉，1.6%；葡萄糖，0.4%；七水硫酸镁，0.28%；pH 6.7～7.0。

(2)斜面培养基：葡萄糖，0.5%；全脂奶粉，2%；酵母浸粉，0.3%；七水硫酸镁，0.28%；琼脂，1.6%。

(3)发酵培养基：葡萄糖，12%；水溶性棉籽饼粉，2.5%；酶水解N-Z-Amine A，0.6%；牛奶蛋白胨，0.5%；酵母浸粉，0.5%；七水硫酸镁，0.28%；碳酸钙，0.3%；豆油，1%；pH 7.0。

1.2.2 培养条件

温度：29℃；相对湿度：35%；转速：220 r/min。

1.3 试剂与仪器

玉米淀粉、酵母浸粉、全脂奶粉、水溶性棉籽饼粉、酶水解N-Z-Amine A、牛奶蛋白胨等为生化试剂，其余试剂均为国产分析纯。

主要使用仪器设备及其型号厂商如下：AE240型精密电子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD型净化工作台，苏州净化设备有限公司；HPS-160型生化培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发公司；THZ-92A汽浴恒温振荡器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；Legend Micro 17R 高速冷冻离心机，Thermo Scientific 公司。

1.4 刺糖多孢菌发酵样品制备及测序

使用斜面培养基分别培养刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株，静置于29℃培养7 d；取适量孢子接入种子培养基中，置于摇床中220 r/min，29℃培养3 d；再按8%接种量将种子培养液接入发酵培养基中，置于摇床中220 r/min，29℃培养7 d；使用Cell Total RNA Isolation Kit(成都福际生物技术有限公司)提取分别刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株的总RNA后构建互补DNA文库，再利用Illumina Hiseq2000测序技术进行测序(北京诺禾致源生物信息科技有限公司)，每个菌株3个重复[19]。

1.5 转录组组装和差异基因表达分析

组装方法参考已报道的文献[19]。利用Stringtie软件进行转录组差异表达分析，再利用Gene Ontology(GO)数据库分析差异表达的基因功能相似性[20]。此外，再使用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库(http://www.genome.jp/kegg/)和KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)软件进行差异基因在KEGG通路的富集分析[19]。

1.6 层次聚类分析

为了进一步分析高产刺糖多孢菌菌株的转录组数据，应用层次聚类将相似的元素聚集在二叉树中。再从基因表达谱中提取DEGs的表达数值并应用pheatmap软件进行层次聚类分析[19]。

1.7 荧光定量PCR

分别提取发酵7 d的刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株的RNA并逆转录成cDNA(RT EasyTMⅡKit, 成都福际生物技术有限公司)，选择显著差异的甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路的7个DEGs进行荧光定量PCR验证。使用Primer Premier 6.0软件设计的引物列于表1中，引物序列由成都擎科伟业生物技术有限公司合成。20 μL荧光定量PCR反应体系为：2×SYBR green mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，正反向引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL(Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I Kit, 成都福际生物技术有限公司)。荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，58℃退火并延伸30 s，共40个循环。溶解曲线参数为: 65℃～95℃，每10 s 上升0.5℃。以Sigma因子sigA作为内参基因[17]，采用2-ΔΔCt法分析比较同一目的基因不同时期的相对表达水平，内参基因和目的基因都做3个复孔。

表1 本研究使用的荧光定量PCR引物Tab.1 Fluorescent quantitative PCR primers used in this study

1.8 氨基酸种类及其添加浓度对多杀菌素产量的影响

参照本实验室发酵方法[18]，在发酵培养基中分别添加不同浓度的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸(0，0.2，1，5，10和15 mmol/L)(北京索莱宝科技有限公司)，于发酵第11天取发酵液1.0 mL，加入5 mL无水乙醇，震摇10 min，高速离心得上清液，HPLC分析多杀菌素的含量。

1.9 统计学分析

实验结果用平均值±标准差(SD)表示。数据均由SPSS 17.0软件处理，采用单因素方差分析(ANOVA)，组间差异采用t检验。P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 测序与组装

为了获得刺糖多孢菌的完整转录组，本研究构建了发酵7 d的SS-168及SS-WT样品组成的cDNA文库并对其进行测序，共计得到了6个测序文库。每个组中均生成了超过1.8×107条原始序列。在过滤和清除不可信数据后，各组分别产生了2.79G、4.23G、3.06G、2.85G、2.7G、3.18G数据。Q20的平均百分比和GC含量均超过了97%和67%(表2)。

表2 转录组测序和组装结果Tab.2 Summary of transcriptome analysis

2.2 基因表达水平分析

基因表达以FPKM计算。为了表征刺糖多孢菌SS-168及SS-WT菌株的mRNA的表达模式，使用FPKM值构建了热图，以确定两个菌株的总体转录组差异(图1)。结果显示在转录组中有超过75%的基因表达了(FPKM＞1)，红色表示高表达基因，蓝色表示低表达基因。

2.3 差异基因分析

通过数据预处理，计算这些基因的log2FoldChange和FDR值，以分析刺糖多孢菌SS-168及SS-WT的差异基因。与SS-WT菌株相比，共在SS-168菌株样本中鉴定出1341个差异基因，包括255个上调基因和1086个下调基因(图2)。

2.4 差异基因的GO分析和KEGG分析

在提取差异基因的表达值后，对差异基因进行层次聚类分析。GO注释将这些差异表达基因参与的生物学功能分为2类：生物过程(biological process)和分子功能(molecular function)(图3)。生物过程主要参与氧化还原过程和脂质代谢。而分子功能方面则包括氧化还原酶活性和辅因子结合及辅酶结合等。GO注释在不同功能类别中的分布表明了差异基因的实质多样性(图3)。

此外，我们确定了由单基因类别代表的生化途径。差异基因的KEGG注释表明，它们分布在与丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢(16个基因)、脂肪酸降解(23个基因)、精氨酸/脯氨酸代谢(23个基因)、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢(26个基因)(表3)。在已确定的功能类别中，微生物多样环境代谢和氨基酸生物合成的比例最高，其次是缬氨酸亮氨酸及异亮氨酸降解、苯丙氨酸代谢和苯丙酮盐代谢。

表3 差异基因富集的显著性KEGG通路Tab.3 The KEGG pathways annotated in the transcriptome

2.5 荧光定量PCR分析

为了比较高产菌株SS-168与原始菌株SS-WT中氨基酸生物合成基因的转录水平差异，选择显著差异的甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路的7个DEGs进行荧光定量PCR检测。由图4可知，与原始菌株SS-WT相比，各7个DEGs的转录水平在高产菌株SS-168中均显著上调，高产菌中soxG、soxB和soxD基因的转录水平分别比原始菌株提高更为显著(图4)。这些比较分析表明，qPCR数据和转录组数据的一致率为100%，证实了RNA-seq数据的准确性。

2.6 氨基酸种类及其添加浓度对多杀菌素产量的影响

基于上述转录组分析和荧光定量PCR分析，本研究进一步探究了氨基酸及其添加浓度对高产菌株SS-168中多杀菌素产量的影响。如图5所示，甘氨酸在添加浓度为1 mmol/L时对多杀菌素产量的促进作用最为显著，添加浓度继续增加时则会降低多杀菌素产量(图5A)。而添加低浓度的丝氨酸对多杀菌素产量的提高无明显效果，只有在添加浓度为15 mmol/L时对多杀菌素产量有显著促进作用(图5B)。苏氨酸的添加浓度为5～15 mmol/L之间时对刺糖多孢菌产多杀菌素产量显著提高，添加浓度低于5 mmol/L时对多杀菌株产量无明显的促进作用(图5C)。通过对添加3种氨基酸的发酵液的HPLC谱图分析发现，发酵液中多杀菌素的含量显著提高，详细谱图见图6(甘氨酸)、图7(丝氨酸)和图8(苏氨酸)。

3 讨论

刺糖多孢菌SS-168是本实验室前期筛选获得的一株多杀菌素产量较高的突变菌株[18]，该菌株基因组中含有23个多杀菌素合成相关基因，包含从丙酸开始的聚酮链合成、大环内酯核分子内的交联反应、鼠李糖糖基的转移和甲基化以及福乐糖胺糖基的合成和连接的全部基因。除此之外，还含有参与鼠李糖合成的gtt、gdh、kre、epi基因[11]。在SS-168转录组样本中鉴定出1341个差异基因，包括255个上调基因和1086个下调基因。分析认为这些基因表达水平的差异可能影响了高产菌株SS-168合成多杀菌素的能力。

将SS-168与SS-WT转录组的GO注释进行对比。其结果反映SS-168在氧化还原相关基因中具有相对较高的遗传多样性水平。这表明在多杀菌素生物合成过程中，相关酶的合成代谢活动旺盛。而KEGG功能分布结果显示在SS-168菌株中的微生物多样环境代谢和氨基酸生物合成代谢通路发生显著性变化。尽管与氨基酸生物合成相比，与微生物多样环境代谢相关的转录物数量要多一些，但微生物多样环境代谢中的大多数途径都参与氨基酸生物合成并在合成系统中发挥重要作用。KEGG注释表明，DEGs主要分布在与丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢通路、脂肪酸降解通路、精氨酸/脯氨酸代谢通路、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路。其中富集在甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路的DEGs最多，因此本研究选择了该通路做进一步的发酵优化。

伍小颖等[21]考察了18种氨基酸添加对多杀菌素产量的影响,其研究结果发现仅精氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸的添加对多杀菌素产量有显著的促进作用，组氨酸、谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的添加对多杀菌素产量变化没有影响，而另外8种氨基酸的添加会降低多杀菌素产量，但并不清楚这些氨基酸与多杀菌素生物合成的内在联系。本研究是基于转录组数据选择了具有显著性差异的甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路，并发现了这些氨基酸添加浓度的变化能影响多杀菌素产量。因此本研究建立的联合转录组学和发酵优化的方法更具有指向性和可操作性。分析认为氨基酸除直接参与多杀菌素合成过程中关键酶的合成，还能通过某些代谢途径转化成中间代谢产物进入到三羧酸循环中，进一步提供刺糖多孢菌生长及其合成代谢所需的能量，这可能是本研究中部分氨基酸(如甘氨酸和苏氨酸)能促进多杀菌素产量的原因；而某些氨基酸如低浓度的丝氨酸对多杀菌素的产量提高作用不显著，可能是由于刺糖多孢菌能够自身合成该氨基酸或利用转氨基作用及时补充。此外有些氨基酸也会抑制多杀菌素的合成，可能是因为氨基酸的添加使得培养基的pH或某些理化因素发生变化，影响刺糖多孢菌的生长，进而导致多杀菌素产量降低。

在类似的聚酮类抗生素如红霉素和阿维菌素等，某些前体物质如油脂类的添加，也能显著的提升抗生素的发酵产量。例如在红霉素的发酵过程中添加豆油作为辅助性碳源，在有效避免发酵液中葡萄糖浓度过大引起的葡萄糖效应的同时促进次级代谢产物如红霉素的合成，其具体原理是菌体分解豆油产生的短链脂肪酸与甘油在经过β-氧化和EMP途径转化后能够形成乙酰辅酶A，改变了葡萄糖浓度过高时的菌体生长代谢的代谢流向，从而使红霉素发酵产量提高[22]。此外，徐瑶[23]发现在阿维菌素的次级代谢产物的合成代谢阶段添加豆油可以提高阿维菌素的发酵产量，且添加浓度仅在0.5%～1.5%范围内与阿维菌素的发酵产量的提高呈现正相关。这一点在其他的研究发现中也得到了例证，如马坤[24]在多杀菌素的发酵优化中发现菜籽油的添加能增强脂肪酶基因及多杀菌素合成基因的表达丰度，促进多杀菌素的合成。油脂代谢可以提供短链脂肪酸作为大环内酯抗生素合成单元，提高产物合成，本研究中的突变株可以更多地利用特殊氨基酸提高多杀菌素的合成，这些氨基酸可能也是作为短链脂肪酸的前体发挥作用。相较于传统的发酵优化，有选择性地优化某一类前体物质为微生物来源的抗生素合成提供了一种高效可行的发酵优化策略。

4 结论

本研究构建了刺糖多孢菌高产突变株SS-168及野生型SS-WT转录组谱。并生成了一个差异基因库，通过对差异基因的GO和KEGG的功能分类确定了多种生物过程和信号通路，包括甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路。实时荧光定量PCR验证了该通路中部分DEGs的转录水平，并通过发酵培养基优化发现甘氨酸与苏氨酸的添加能显著提高多杀菌素产量，而添加低浓度的丝氨酸对多杀菌素产量变化无明显效果。本研究为改良刺糖多孢菌菌株和优化发酵工艺提供重要的理论基础和参考依据。