山东省玉米青枯病主要致病菌的分离鉴定及优势致病菌的致病性测定

刘新，任凤山，徐晓辉，孙红炜，李凡，杨淑柯，郝超峰，路兴波

（1.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院植物保护研究所/山东省植物病毒学重点实验室，山东 济南 250100）

玉米青枯病也被称为茎基腐病、茎腐病、晚枯病等，在我国各玉米产区均有发生，正常年份发病率在10%～20%，多雨年份发病率可达40%以上［1］。近年来，由于种植玉米品种单一、气候变化、耕作制度改革等原因，玉米青枯病的危害不断加重。

关于玉米青枯病的病原，目前研究结果尚不统一，迄今已报道的病原菌有20多种，不同国家或者同一国家不同地区病原菌种类存在较大差异。在美国，禾谷镰孢菌、串珠镰孢菌和玉蜀黍色二孢菌是玉米茎腐病主要致病菌［2－4］，腐霉菌主要危害苗期和散粉前的玉米植株［5，6］。俄罗斯和乌克兰的玉米青枯病致病菌以禾谷镰孢菌为主，西欧则以玉米穗粒干腐菌和串珠镰孢菌为主［4，7－9］。徐作珽等［10］报道山东省玉米青枯病系瓜果腐霉与禾谷镰孢菌复合侵染所致，两种病菌复合侵染能加重病害的发生。经过多年研究，国内学者普遍认为其致病原因主要有以下四种:一是以禾谷镰孢菌、串珠镰孢菌为代表的多种镰孢菌引起的［11，12］；二是以禾生腐霉和肿囊腐霉等腐霉菌侵染引起的［13－15］；三是以瓜果腐霉为主、禾谷镰孢菌为辅的复合侵染所致［10］；四是腐霉和镰孢菌都是主要致病菌，在不同气候条件下，二者的发生程度发生变化，在少雨低湿地区镰孢菌为主要致病菌，而在多雨地区腐霉菌为主要致病菌［16］。

玉米青枯病是一种典型的土传病害，病原菌以卵孢子形式单独或随病残体在土壤中越冬。次年病原菌从侵染植物内皮层外的细胞开始，随后通过皮层，沿着薄壁细胞纵横发展后，入侵维管束，并向上扩展蔓延，导致植物体内运输通路的破坏，最终导致玉米枯死［17］。玉米青枯病始发期为灌浆末期至乳熟初期，高发期为乳熟后期至蜡熟期。

关于山东省玉米青枯病的研究多集中在20世纪70—90年代，近期对山东省玉米青枯病的研究较少，其病原种类及优势种尚不明确。本研究通过对山东省6市玉米青枯病病原菌的分离鉴定，确定了各地主要致病菌的种类及优势种，为山东省玉米青枯病防治措施的建立奠定了基础，对保障我国粮食产量和食品、饲料安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病样采集

于2014—2016年采集山东省6市玉米种植区病样，采样地点包括济南市（历城区、章丘区）、滨州市（惠民县、阳信县）、潍坊市（临朐县、昌邑市）、聊城市（高唐县、冠县）、枣庄市（峄城区、山亭区）、菏泽市（曹县、单县）。

1.2 病原菌分离、纯化

用灭菌解剖刀拨开玉米病样，在病健交界处剪取约0.3 cm×0.2 cm的维管束样品，75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗3次，置于PDA和WA两种培养基中，每个平板上放置5块病组织，重复3次。25℃培养2～7 d。挑取菌落边缘于PDA（镰孢菌）或WA（霉菌）培养基上进行纯化，采用稀释法对纯化得到的菌株进行单孢分离并保存。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 病原菌的形态学鉴定 根据各菌株菌落形态、颜色、分生孢子大小及形态等，按照《真菌鉴定手册》［18］《常见镰孢菌鉴定指南》［19］等文献资料，将其鉴定到种。腐霉菌的鉴定参照相关文献［20，21］将其鉴定到种。

1.3.2 病原菌的分子鉴定 提取病原菌DNA，采用真菌、镰孢菌的通用引物以及镰孢菌的种特异性引物进行PCR扩增（表1）。PCR反应体系:DNA模板2.0μL，10μmol/L上游引物和下游引物各0.5μL，2×TaqMaster Mix 12.5μL，补ddH2O至25μL。反应程序:94℃预变性4 min；94℃变性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，共35个循环；72℃延伸7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段经DNA胶回收试剂盒回收纯化后，克隆到pMD19－T simple载体中，阳性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司进行测序。以测得序列为索引，在NCBI数据库中进行Blast比对，获得各菌种的种属信息。

表1 病原菌鉴定所用引物

将鉴定出的各种致病菌进行数量统计，并按以下公式计算其分离频率。

分离频率（%）＝（分离所得菌株数/分离的菌种样本数）×100 。

1.4 病原菌的致病力测定

采用牙签法进行致病力测定。将灭菌牙签尖放入培养皿中，倒入PDA直至没过牙签，盖上皿盖高温灭菌25 min。取出后置于超净工作台，晾干后接种培养一周的病原菌，封上封口膜，培养箱中培养5～10 d，待菌丝布满整个培养皿，备用。

以3～5叶期的玉米幼苗为材料，先用消毒棉将植株根上部茎节擦拭干净，再用剪刀在茎节处刺伤一个小孔，然后把病原菌处理过的1～2根牙签塞进小孔，即完成接种。以不接种病原菌、但以同样方法插入牙签至玉米幼苗茎中作为对照。每种病原菌接种20株，接种后10 d对植株的发病情况进行调查，统计发病率及病情指数。病情分级标准如下:0级，不发病；1级，接种茎节腐烂变色面积占1%～25%；2级，接种茎节腐烂变色面积占26%～50%；3级，接种茎节腐烂变色面积占51%～75%；4级，接种茎节腐烂变色面积占76%～100%；5级，侵染扩展到邻近茎节；6级，植株死亡。

病情指数计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 山东省玉米青枯病病原菌种类和分布

山东省6市除滨州市和枣庄市青枯病成片发生外，其余地区均为点状发生。症状表现较为一致，叶片自下往上逐渐变黄枯死，果穗下垂不脱落，茎基部外部有大面积不规则褐色病斑，内部腐烂，严重者能用手撕开，可见褐色维管束和一些微红色菌丝。

2014—2016年共采集获得117份玉米青枯病样品，经分离纯化共获得393株病原菌，对其进行鉴定发现主要为镰孢菌属（Fusariumspp.）和腐霉属（Pythiumspp.）。镰孢菌属病原菌主要为禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌，腐霉属病原菌主要为芒孢腐霉和强雄腐霉。

不同年份和地点的玉米青枯病致病菌均包含禾谷镰孢菌，但是其它致病菌种类差别较大。2014年滨州、潍坊和菏泽的致病菌中禾谷镰孢菌分离频率最高，其余地市则为拟轮枝镰孢菌分离频率最高，腐霉菌以芒孢腐霉为主（表2）。2015年各地市分离的禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌数量相当，腐霉菌仍以芒孢腐霉为主（表3）。2016年各地市分离的致病菌均以拟轮枝镰孢菌为主（表4）。

表2 2014年分离得到的病原菌分布情况

表3 2015年分离得到的病原菌分布情况

表4 2016年分离得到的病原菌分布情况

2.2 病原菌的致病力测定

从全部分离物中选择3种有代表性的菌株——禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌、芒孢腐霉进行致病力测定，以郑单958为供试品种。

致病力测定结果（表5）显示，3种青枯病主要致病菌均具有致病力，接种后发病率均为100%。不同致病菌致病力不同，禾谷镰孢菌致病力最强，对植株生长影响最大，接种部位完全被病原菌侵蚀并腐烂；拟轮枝镰孢菌对植株生长的影响次之，接种部位聚集大量菌丝，植株生长受限；芒孢腐霉对植株生长的影响较小，接种部位有部分菌丝侵入，生长受限（图1）。

表5 玉米青枯病病原菌致病力

图1 玉米苗接种致病菌后的症状表现

3 讨论与结论

玉米青枯病是一种复杂的土传病害，不同地区的优势致病菌存在较大差异。徐作珽等［10］的研究结果表明，山东省玉米青枯病主要由禾谷镰孢菌和瓜果腐霉复合侵染所致。本试验结果表明，不同年份山东省各地市的优势致病菌存在差别，整体看来，近几年拟轮枝镰孢菌正在取代禾谷镰孢菌成为玉米青枯病的主要致病菌。另外还分离到了芒孢腐霉和强雄腐霉，且部分地市芒孢腐霉检出率逐渐上升。同一个样本中往往可以分离到多个致病菌，这也表明多个病原菌的复合侵染仍是山东省玉米青枯病发生的重要原因。

孔令晓等［22］对河北省玉米青枯病的优势致病菌禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌和腐霉菌进行了致病力研究，结果发现3种病原菌单独或复合接种都会使植株产生青枯病的症状，且复合接种的致病力高于各病原菌单独接种。本试验致病力结果表明，禾谷镰孢菌致病力最强，拟轮枝镰孢菌次之，芒孢腐霉致病力最弱。多数研究表明，相较于其它镰孢菌，禾谷镰孢菌致病力最强［23－26］，其主要通过根部入侵导致发病。拟轮枝镰孢菌除可通过根入侵玉米植株外，还可以通过种子带菌或经叶鞘和茎节连接处入侵玉米植株，引起青枯病。此外，拟轮枝镰孢菌也是导致玉米穗腐病和鞘腐病的主要病原菌［27，28］。因此，加强拟轮枝镰孢菌发生规律、致病机理和综合防控技术的研究对于山东地区的玉米青枯病、穗腐病和鞘腐病的防治具有重要意义。