柚皮苷转化生成红花素及异红花素的研究

李业英 马瑛 崔晓兰 尹力新 穆云龙 单越琦 路新华 沈文斌

(1 微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，华北制药集团新药研究开发有限责任公司，石家庄 052165；2 华北制药股份有限公司，石家庄 050015)

柚皮苷和柚皮素是一种广泛存在于芸香科植物中的二氢黄酮类化合物，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗突变、抗雌激素、抗动脉粥样硬化和抗癌等[1-2]，近年来受到人们越来越多的重视和研究。柚皮苷和柚皮素的生物活性在某种程度上都与其抗氧化的特性有关，抗氧化特性又取决于化合物中羟基数量的多少以及是否存在相邻的羟基。因此可通过化学或生物合成的方法在柚皮苷或柚皮素中引入额外的羟基，获得抗氧化活性增强的衍生物，并将其用于食品添加剂和临床药物的研发[3]。

红花素和异红花素是柚皮素羟基化修饰后的产物，结构中都含有邻近的羟基，具有很强的抗氧化活性，其抗氧化活性要强于柚皮苷和柚皮素[4]，特别是异红花素，其抗氧化活性几乎与维生素E相当[5]。红花素和异红花素还具有抗糖尿病活性，已经用于抗糖尿病制剂的研发[6]。红花素除了对晶状体醛糖还原酶具有显著的抑制作用外[7]还具有较强的对抗由组织胺引起的平滑肌收缩作用，同时还有很好的祛痰作用，是治疗慢性支气管炎的有效成分[8]。异红花素是酪氨酸酶的自杀性底物，作为酪氨酸酶抑制剂可用于防止水果褐化、蔬菜保鲜、治疗一些与黑色素色素沉着和神经退行性相关的皮肤病，可用于化妆品以及昆虫控制[5]。

红花素和异红花素可以从红花、半枝莲和黄芩等天然植物中提取得到[8,10-11]，但其在植物中的含量较低[3,5]，获取困难，例如Werawattanachai等[5]从4.8 kgParinari anamense中分离得到25 mg异红花素，严重限制了它们的应用。人们一直在寻找经济实用的获取方法，Miyake等[4]利用斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)转化柚皮苷获得红花素和异红花素，赵淑娟等[9]和Jing等[3]利用黑曲霉，Anna等[5]利用红酵母转化柚皮素获得红花素和异红花素，但红花素和异红花素的总产量较低，最高总共约有233.3 mg/L。柚皮素水溶性较柚皮苷差且需要通过酶解或水解柚皮苷获得[12-13]。因此，由柚皮苷直接转化生成红花素和异红花素并提高产量具有一定的意义。

本文报道一株日本曲霉能够直接将柚皮苷转化生成红花素和异红花素，且发酵单位较高。由日本曲霉直接转化柚皮苷生成红花素和异红花素还未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

菌株编号F06Z0123，本实验室分离自重庆市江津四面山土壤，鉴定为日本曲霉，现保藏于本实验室。

1.1.2 主要仪器与试剂

1.1.3 培养基

种子培养基：淀粉1%，葡萄糖2%，麦芽粉0.6%，热豆粉0.2%，氯化钠0.2%，碳酸钙0.2%，pH自然。

发酵及转化培养基：淀粉3%，麦芽粉0.4%，热豆粉0.3%，氯化钠0.2%，碳酸钙0.15%，pH自然。

1.1.4 底物的配制

称取柚皮苷1.2 g，溶于75 mL 50%的乙醇溶液中，改进后为溶于75 mL 26.6%的热乙醇溶液中；浓度均为16 mg/mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养和底物转化

将菌株孢子液0.2 mL接种到装有40 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，硅胶塞通气，26℃，200 r/min培养24 h；种子液以3%接种量接种到装有40 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，硅胶塞通气，26℃，200 r/min培养72 h后将摇床转速降至60 r/m。发酵液中加入50%乙醇溶解的底物5 mL，发酵培养基中底物终浓度为2 mg/mL。从加入底物开始计算转化时间，一般转化36 h结束。

1.2.2 有机氮源对转化的影响

将发酵培养基中的热豆粉等量替换为生物氮素、酵母粉、棉籽粉、玉米浆粉、蛋白胨、花生饼粉，考察常用氮源对转化的影响。

1.2.3 热豆粉添加浓度对转化的影响

调整热豆粉添加浓度为0.2%、0.3%和0.4%，考察热豆粉浓度对转化的影响。

1.2.4 微量元素及含量对转化的影响

在发酵培养基中添加硫酸锌、硫酸亚铁及氯化锰，添加浓度均为0.01%，考察添加微量元素对发酵的影响，并对微量元素的添加浓度进行试验。

1.2.5 摇床转速的影响

转化时的摇床转速会影响到发酵培养基的通气和物料的混匀，试验了摇床转速对转化的影响。所用摇床的偏心距为2.5 cm。

1.2.6 底物添加浓度及添加方式对转化的影响

通过使用热乙醇水配制底物溶液，将乙醇的浓度降低至26.6%，在此基础上将底物添加终浓度提高至3和4 mg/mL。对照仍旧用50%乙醇配制底物，添加终浓度为2 mg/mL。

提高底物添加终浓度后，比较一次添加和二次添加底物方式对转化的影响。二次添加方式是在第一次添加底物12 h后，再次添加等量的底物。

1.2.7 转化时间的确定

采用二次添加底物方式后，考察时间对转化的影响。

1.2.8 HPLC检测方法

岛津LC-20AT，纳微Nano-Micro C18柱(4.6 mm×15 cm)，柱温30℃，25%～60%乙腈梯度(含0.5%三氟乙酸)，流速1 mL/min。0～2 min，25%乙腈；2～5 min，25%～60%乙腈；5～14 min，60%乙腈；14～15 min，60%～25%乙腈；15～20 min，25%乙腈；进样10 μL。

2 结果与分析

2.1 有机氮源对转化的影响

从图1中可以看出，当发酵培养基中的氮源为生物氮素、棉籽粉和花生饼粉时，底物脱糖生成的柚皮素大量积累，只有很少量的红花素和异红花素生成。当发酵培养基中的氮源为热豆粉、玉米浆粉和蛋白胨时，产物中有较多的红花素和异红花素生成，以热豆粉转化效果较优。

2.2 热豆粉浓度对转化的影响

从图2中可以看出，热豆粉浓度的提高，有利于异红花素的生成，对红花素影响不大，但继续提高热豆粉浓度会对异红花素的生成产生抑制。综合考虑红花素和异红花素的产量，将热豆粉的含量定在0.3%较为合适。在此浓度下红花素发酵单位为66 μg/mL，异红花素单位为263 μg/mL。

2.3 微量元素及含量对转化的影响

从图3中可以看出与对照相比，添加氯化锰有利于异红花素的生成；硫酸亚铁的添加有利于红花素的生成，但会减少异红花素的生成。

从图4中可以看出，硫酸亚铁浓度为0.02%时比较有利于红花素及异红花素的生成。

从图5中可以看出，氯化锰对红花素的生成影响不大，氯化锰浓度为0.01%时比较有利于异红花素的生成。

从图6中可以看出，同时添加有较适浓度的硫酸亚铁和氯化锰的发酵培养基更能促进红花素、异红花素的生成。在此条件下红花素单位达到253 μg/mL，异红花素单位达到427 μg/mL。

2.4 摇床转速对转化的影响

从图7中可以看出，降低和提高摇床转速后红花素、异红花素的生成量都发生了下降，尤其是摇床转速提高后的生成量明显下降，推测可能是提高摇床转速时日本曲霉对红花素和异红花素产生了消耗。降低摇床转速时，中间产物柚皮素出现大量积累。

2.5 底物添加浓度的影响

实验中发现，如果使用50%浓度的乙醇配制底物，当继续提高底物终浓度时会导致红花素和异红花素大幅下降，甚至无产物生成。分析可能是提高底物浓度后，过多的乙醇对菌株产生了毒害。改进底物配制方法，使用乙醇浓度为26.6%的热乙醇水溶液溶解底物，进行底物添加浓度实验。

从图8中可以看出，采用乙醇浓度降低至26.6%的底物配制方法，底物终浓度由2 mg/mL提高到4 mg/mL后，红花素和异红花素的产量都有所提高且柚皮素的含量也逐步提高。在底物终浓度为4 mg/mL时，红花素单位为326 μg/mL，异红花素单位为635 μg/mL。

2.6 底物添加方式的影响

从图9中可以看出，在底物终浓度为4 mg/mL时，底物分两次添加更有利于红花素和异红花素的生成。两次添加方式下红花素单位为373 μg/mL，异红花素单位为906 μg/mL。

2.7 转化时间的影响

采用二次添加底物的转化方法后，转化时间由36 h延长至48 h产物达到最高值，此时红花素发酵单位389 μg/mL，异红花素发酵单位946 μg/mL，图10。

3 讨论

文献报道通过生物转化的方式获得红花素和异红花素可利用的菌株有斋藤曲霉、黑曲霉和红酵母。本文的研究增加了获取红花素和异红花素的菌株来源。

使用生物转化法获取红花素和异红花素可利用的底物有柚皮苷和柚皮素。目前已报道的能够利用柚皮苷作为底物的菌株只有斋藤曲霉，本文显示日本曲霉同样能够转化柚皮苷获得红花素和异红花素。相比于柚皮素，柚皮苷更易从自然界植物中获得[14-15]，并且柚皮苷的水溶性较柚皮素好，作为底物更具有优势。同时我们在实验中发现，该菌株在一定条件下也可高效得将柚皮苷主要水解为柚皮素，所以该菌株不仅可以用于红花素和异红花素的产生，也可用于柚皮素的产生。

本文对一株日本曲霉直接转化柚皮苷生成红花素和异红花素进行了研究，结果显示发酵培养基组分和发酵条件对转化都具有重要的影响。发酵培养基组分研究显示热豆粉是转化的最适氮源，这可能与热豆粉中含有较多的黄酮类物质有关，对转化酶系的合成具有一定的诱导作用。微量元素对酶活性具有调节作用。实验发现添加不同的微量元素只会促进单一产物如红花素或异红花素的生成，这表明由柚皮苷生成红花素和异红花素可能是由两种酶分别作用的，且两种酶的酶活性具有差异，因为无论通过柚皮苷还是柚皮素作为底物，产物中异红花素的含量往往要高于红花素，说明更倾向于生成异红花素。摇床转速会影响产物的生成，推测是通过影响发酵培养基的通气造成的。因为由柚皮素羟基化生成红花素和异红花素是一氧化过程，需要一定的通气量，但通气量过多或过少都不利于红花素和异红花素的积累。通气过少可能会造成底物和中间产物柚皮素的积累，减少红花素和异红花素的生成，通气过大可能会消耗掉已生成的红花素和异红花素。

底物溶液中助溶剂乙醇的浓度和过高的底物浓度对转化也有不利的影响。通过改变底物配制方法，使用热乙醇水进行底物配制，大大降低了底物溶液中乙醇的浓度，减轻了对反应酶系的抑制作用。而通过多次添加底物方式避免了一次加入高浓度底物对转化的抑制作用。

总之，我们通过试验实现红花素和异红花素发酵单位的大幅度提升，红花素发酵单位达到389 μg/mL，异红花素发酵单位达到946 μg/mL。