石见穿多糖通过PTEN通路对骨肉瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫功能的影响*

杨健，张立喜，史博

（1.沧州市中心医院骨科，沧州 061001；2.唐山市丰南区医院骨科，唐山 063300；3.沧州人民医院骨科，沧州 061000）

骨肉瘤每年每百万人中约有4～5人发病，本身发病率不高，但多见于10～20岁青少年，恶性程度及病死率高，近几十年患者生存率并未得到改善，严重危及患病人群生命[1]。化疗结合手术是目前治疗骨肉瘤的主要方式，可提高患者生存质量，但此治疗手段预后较差，探索安全有效的治疗方法有重要意义。随着临床对骨肉瘤研究深入，国内外学者均发现[2-3]免疫疗法或可成为骨肉瘤治疗新前景。石见穿是华鼠尾草地上部分，具有散结消肿、清热利湿之效，被应用于癌症治疗中，并显示出肯定效果[4]，而其有效成分石见穿多糖（PSSC）具有抗肿瘤免疫调节作用[5]，目前已有研究表明，PSSC可通过Wnt/β-catenin 信号通路[6]、增强 γδT 细胞[7]来发挥骨肉瘤细胞杀伤作用。此外，另有研究发现[8]，癌症患者抗肿瘤免疫与骨髓细胞中抑癌基因第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（PTEN）表达相关，但PSSC是否对PTEN表达有影响，临床鲜有研究。基于此，研究建立骨肉瘤小鼠模型，探讨PSSC通过PTEN通路对骨肉瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫功能的影响，为临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 取60只BALB/C雄性裸鼠（北京唯尚立德生物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0009），6 周龄，体质量 17～22 g，SPF 级环境独立通风笼具（IVC）饲养，12 h明-暗交替，23～25℃温度，50%～60%湿度，自由摄食饮水。

1.1.2 主要仪器与试剂 PSSC（成都彼样生物科技有限公司）、MG-63人骨肉瘤细胞（上海北诺生物科技有限公司）、RPMI 1640培养基（上海跃腾生物技术有限公司）、吖啶橙-溴乙锭染色液（上海麦克林生化科技有限公司）；CD4+、CD3+抗体及 PTEN、磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）抗体（Abcam 公司）；流式细胞仪（Attune NxT，赛默飞世尔科技公司）、转印电泳仪（DYCZ-40D，武汉纯度生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立骨肉瘤小鼠模型 细胞培养，使用RPMI 1640培养基（含有10%胎牛血清、50 mg/mL链霉素、50 U/mL青霉素）培养MG-63人骨肉瘤细胞，在5% CO2、37℃培养箱中培养，定期更换培养液，观察细胞生长情况。

构建模型[9]，将小鼠饲养在无菌层流柜中，1周后，乙醇消毒，将对数生长期MG-63细胞皮下注射至小鼠右侧臀部，剂量为0.1 mL（1×107个），观察小鼠成瘤情况，1周后裸鼠长出皮下肿块（肿瘤直径约1 cm）为建模成功，剪脚趾标记，弃去成瘤失败小鼠。

1.2.2 分组与干预方法 60只小鼠，取12只为对照组，另外48只建立骨肉瘤小鼠模型，成功建模42只，随机分为模型组（11只）、PSSC低剂量组（11只）、PSSC高剂量组（10只）、顺铂组（10只）。

建模成功第2日开始干预，PSSC低剂量组、PSSC高剂量组分别每日腹腔注射PSSC10、100mg/kg；顺铂组腹腔注射顺铂2 mg/kg，于开始干预第1、4、7、10、13天各给药1次；对照组与模型组每日腹腔注射等体积生理盐水，各组小鼠均为每日干预1次，连续注射2周。

1.2.3 移植瘤体积变化 干预期间每2 d测量1次小鼠移植瘤最短径、最长径，观察移植瘤生长情况，计算体积（最短径2×最长径/2），绘制小鼠肿瘤生长曲线。

1.2.4 流式细胞仪测定小鼠外周血淋巴细胞亚群 末次测量结束后，摘眼球取血，肝素钠震荡抗凝，300×g，离心半径16 cm，离心5 min取血清，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬调整细胞浓度，添加抗体，避光孵育30 min（4℃），加细胞裂解液，室温孵育5 min，加PBS终止，同上述条件离心，加流式缓冲液洗涤，再次离心，加细胞固定液过夜，并进行筛滤，使用流式细胞仪检测外周血CD4+、CD3+T细胞比例。

1.2.5 天平测定小鼠移植瘤质量 取血结束后，断颈处死小鼠，无菌分离出肿瘤组织，使用天平称质量，记录移植瘤质量。

1.2.6 苏木精-伊红（HE）染色观察肿瘤病理组织变化 取部分肿瘤组织，4%多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，制作出4 μm厚度切片，将切片脱蜡、水化，常规HE染色，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察肿瘤病理变化。

1.2.7 统计肿瘤细胞凋亡率 取移植瘤组织，制成单细胞悬液，吖啶橙-溴乙锭染色，荧光显微镜扫描，识别细胞类型，阳性凋亡细胞：细胞核呈棕褐色；正常细胞：亮绿色荧光，细胞质均匀，镜下随机选4个视野统计细胞，计算凋亡率。

1.2.8 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测移植瘤组织PTEN、PI3K及p-Akt蛋白表达 于移植瘤组织中加入蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，离心12000r/min，离心半径8 cm，10 min，取上清液，取蛋白样品30 g，与12.5%SDS-PAGE中进行蛋白分离，将蛋白转印于聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并将其放入5%脱脂奶粉中，封闭1 h，TBST洗膜，加入兔抗小鼠PTEN（稀释1∶500）、PI3K（稀释1∶800）、p-Akt（稀释1∶800）、β-actin（稀释 1∶1 000）抗体孵育，回收一抗，TBST 洗涤，加稀释（均为1∶2 000）山羊抗兔抗体，孵育洗涤，曝光检测，分析蛋白条带，以β-actin为内参，目的蛋白条带灰度值与β-actin内参条带灰度值比值为目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植瘤体积 生长曲线显示，随干预时间延长，各组小鼠移植瘤体积逐渐增长，干预第2、4天4组小鼠移植瘤体积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；干预第 6、8、10、12、14 天 PSSC 低剂量组、PSSC 高剂量组、顺铂组小鼠移植瘤体积低于模型组，且PSSC高剂量组、顺铂组小鼠移植瘤体积低于PSSC低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；干预第 6、8、10、12、14天PSSC高剂量组、顺铂组两组小鼠移植瘤体积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组小鼠移植瘤体积生长曲线Fig.1 Growth curve of transplanted tumor volume of mice in each group

2.2 移植瘤质量 4组小鼠移植瘤质量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两两比较显示，PSSC低剂量组、PSSC高剂量组、顺铂组小鼠移植瘤质量低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PSSC高剂量组、顺铂组小鼠移植瘤质量低于PSSC低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PSSC高剂量组、顺铂组两组小鼠移植瘤质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠移植瘤质量比较（±s）Tab.1 Comparison of transplanted tumor quality of mice in each group（±s）g

表1 各组小鼠移植瘤质量比较（±s）Tab.1 Comparison of transplanted tumor quality of mice in each group（±s）g

注：与模型组比较，*P＜0.05；与 PSSC 低剂量组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 移植瘤质量模型组 11 0.92±0.21 PSSC低剂量组 11 0.65±0.16*PSSC高剂量组 10 0.34±0.10*#顺铂组 10 0.31±0.09*#

2.3 外周血淋巴细胞亚群 5组小鼠外周血CD4+、CD3+T细胞比例比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两两比较显示，模型组外周血CD4+、CD3+T细胞比例低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；PSSC低剂量组、PSSC高剂量组外周血CD4+、CD3+T细胞比例高于模型组，顺铂组外周血CD4+、CD3+T细胞比例低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；PSSC高剂量组外周血CD4+、CD3+T细胞比例高于PSSC低剂量组，顺铂组外周血CD4+、CD3+T细胞比例低于PSSC低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠外周血CD4+、CD3+T细胞比例比较（±s）Tab.2 Comparison of CD4+and CD3+T cells in peripheral blood of mice in each group（±s）%

表2 各组小鼠外周血CD4+、CD3+T细胞比例比较（±s）Tab.2 Comparison of CD4+and CD3+T cells in peripheral blood of mice in each group（±s）%

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与 PSSC 低剂量组比较，△P＜0.05。

组别 动物数 CD4+T细胞 CD3+T细胞对照组 12 44.38±6.22 60.04±7.03模型组 11 26.02±3.87* 38.17±4.68*PSSC 低剂量组 11 29.97±4.15# 45.02±5.01#PSSC 高剂量组 10 35.17±4.46#△ 51.14±5.47#△顺铂组 10 22.69±3.01#△ 31.22±4.95#△

2.4 肿瘤病理组织变化 模型组肿瘤细胞核大而深染，核浆比值高，细胞膜完整，整体排列紧密；干预后，PSSC低剂量组、PSSC高剂量组、顺铂组出现不同程度改变，PSSC低剂量组细胞核染色稍浅，细胞膜轮廓不清，部分细胞核分裂，肿瘤细胞密度降低，而PSSC高剂量组、顺铂组上述变化程度进一步加重，细胞核固缩，核分裂明显，细胞结构明显不完整，坏死区域增大。见图2。

图2 各组小鼠HE染色肿瘤病理变化（×200）Fig.2 Pathological changes of tumor stained with HE in mice of each group(×200)

2.5 肿瘤细胞凋亡率 4组小鼠肿瘤细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两两比较显示，PSSC低剂量组、PSSC高剂量组、顺铂组小鼠肿瘤细胞凋亡率高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PSSC高剂量组、顺铂组小鼠肿瘤细胞凋亡率高于PSSC低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PSSC高剂量组与顺铂组小鼠肿瘤细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡率比较（±s）Tab.3 Comparison of tumor cell apoptosis rate of mice in each group（±s）%

表3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡率比较（±s）Tab.3 Comparison of tumor cell apoptosis rate of mice in each group（±s）%

注：与模型组比较，*P＜0.05；与 PSSC 低剂量组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 凋亡率模型组 11 3.01±1.14 PSSC低剂量组 11 12.03±3.95*PSSC高剂量组 10 29.45±4.01*#顺铂组 10 30.07±4.34*#

2.6 移植瘤PTEN、PI3K及p-Akt蛋白表达 4组小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两两比较显示，PSSC低剂量组、PSSC高剂量组、顺铂组移植瘤PTEN蛋白表达高于模型组，移植瘤PI3K、p-Akt蛋白表达低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PSSC高剂量组、顺铂组移植瘤PTEN蛋白表达高于PSSC低剂量组，移植瘤PI3K、p-Akt蛋白表达低于PSSC低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PSSC高剂量组、顺铂组两组移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表4。

图3 各组小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表达Fig.3 Expression of PTEN，PI3K and p-Akt proteins in transplanted tumors of mice in each group

表4 各组小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt1蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，PI3K and p-Akt1 protein expression in transplanted tumors of mice in each group（±s）

表4 各组小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt1蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，PI3K and p-Akt1 protein expression in transplanted tumors of mice in each group（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与 PSSC 低剂量组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 PTEN PI3K p-Akt模型组 11 0.14±0.30 0.93±0.13 0.89±0.10 PSSC 低剂量组 11 0.50±0.06* 0.81±0.11* 0.75±0.09*PSSC 高剂量组 10 0.83±0.09*# 0.50±0.08*# 0.46±0.07*#顺铂组 10 0.86±0.10*# 0.47±0.09*# 0.45±0.08*#

3 讨论

近年来，研究发现中药提取物逐渐被应用于骨肉瘤新靶点治疗中，在阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡等方面显示出独特的优势[10-11]。周文静等[10]学者发现，石见穿治疗肺癌的机制与抗炎、抑制肿瘤血管新生等有关；而另有学者总结发现[11-12]石见穿提取物中的多糖、三萜、多酚等有效成分能抑制肿瘤细胞增殖与转移，诱导凋亡，而PSSC是石见穿主要活性成分，可诱导细胞凋亡、线粒体损伤，可通过阻碍Wnt/β-catenin信号通路来抑制肿瘤转移、侵袭。本研究建立骨肉瘤小鼠模型，予以不同方式干预，结果发现PSSC可阻滞肿瘤细胞周期，诱导骨肉瘤细胞凋亡，肿瘤细胞无法无限制复制繁殖，降低移植瘤体积与质量，减轻小鼠肿瘤病理变化程度，以抑制肿瘤进展。

目前证实PTEN作为抑癌基因，PTEN缺失可使机体不同程度失去抵抗肿瘤的能力[13]。有学者发现[14-15]，通过靶向PTEN，可促进骨肉瘤细胞增殖或凋亡，临床或可通过直接靶向骨肉瘤PTEN来研发相关药物，以发挥更为安全有效的用药价值。本研究进一步分析PSSC在骨肉瘤小鼠T淋巴细胞群与PTEN相关蛋白表达中的作用发现PSSC在提高小鼠免疫能力与促进PTEN表达方面有肯定效果，且PSSC高剂量组效果优于低剂量组，另外PSSC高剂量组蛋白表达水平与顺铂组无统计学差异，但顺铂组出现明显免疫抑制，从而表明PSSC可通过激活PTEN、抑制PI3K/p-Akt表达来促进肿瘤细胞凋亡，还可提高小鼠免疫活性，多靶点整体提高抑癌效果。

综上，PSSC可增强骨肉瘤小鼠免疫活性，降低移植瘤体积、质量，提高肿瘤细胞凋亡率，其机制可能是PSSC可激活PTEN通路，促进PTEN蛋白表达，降低PI3K、p-Akt蛋白表达以发挥抑癌作用，为临床骨肉瘤药物研发提供新思路及理论支持。