代谢物在肝内胆管癌诊治及预后评估中的应用探讨

2022-07-29汤朝晖于小鹏童焕军陈家璐刘深洋全志伟

上海医学 2022年4期

汤朝晖于小鹏童焕军陈家璐刘深洋全志伟

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是仅次于肝细胞肝癌的原发性肝脏恶性肿瘤。近年来，发病率呈明显上升趋势[1]。ICC起病隐匿、恶性程度高、预后差，故早期诊断、及时评估疗效、准确判断预后尤为重要。肿瘤细胞的生存环境相对“恶劣”，为了满足自身生物原料的合成及能量需求，常通过代谢重编程，实现快速生长。随着对肿瘤生物学及代谢复杂性的深入了解，学者发现代谢重编程是恶性肿瘤发生的标志之一[2]。流行病学研究[1]显示，机体代谢紊乱导致的糖尿病、高脂血症、超重或肥胖等与ICC关系密切。肝脏是机体代谢的主要调节器，负责协调清除毒素，平衡葡萄糖、脂质和氨基酸摄入，维持机体代谢稳态。慢性肝脏疾病如病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化等均可导致肝脏局部代谢紊乱，甚至影响全身代谢稳态，亦是ICC发生的重要原因之一。

肿瘤发生、发展过程涉及复杂的分子生物学机制，对分子调控网络的研究有助于识别肿瘤早期诊断及判断预后的关键生物学标志物。过去，针对标志物的研究多基于基因及蛋白质层面，如p53、KRAS基因突变，胚胎抗原、糖类抗原的蛋白质改变等。近年来，以代谢重编程为切入点，学者们开始研究ICC相关的肿瘤代谢调控网络及代谢物检测，通过质谱检测等手段探索ICC相关的代谢物变化特征，寻求有效的生物学标志物，从而早期诊断疾病，预测治疗靶点及临床预后。

1 代谢物在恶性肿瘤中的应用及探索

自Otto Warburg提出肿瘤细胞需消耗大量葡萄糖，在有氧情况下主要依靠糖酵解代谢产生能量后，学者们便在肿瘤异常代谢领域不断探索。代谢标志物在肿瘤的临床诊断、治疗及预后判断中的应用逐步受到重视，激发了学者们不断寻找临床应用价值较高的代谢标志物的热情。2009年，Sreekumar等[3]通过质谱技术发现了一种区分良、恶性前列腺肿瘤的代谢标志物——肌氨酸。在后续十几年间，尿液中肌氨酸水平在前列腺癌早期诊断及预后判断中的应用价值受到广泛研究。相较于血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)，尿肌氨酸水平在一定程度上反映了前列腺癌的病理学分级，即Gleason评分越高，尿肌氨酸水平越高。随着研究的进展，越来越多的代谢标志物进入研究者的视野。Yong等[4]发现，某些常规代谢物的异常积累具有促癌作用；在肾脏肿瘤中，延胡索酸(Fumarate)、琥珀酸(Succinate)、2-羟戊二酸(2-hydroxyglutarate，2-HG)的异常累积与患者疾病不良预后相关。除判断预后外，已有多项研究利用异常积累的代谢物指导肿瘤的早期诊断、靶向治疗及术中决策。使用超极化磁共振成像(hyperpolarised magnetic resonance imaging，hpMRI)实时观察同位素标记13C-谷氨酰胺转化为2-HG的情况[5]，可用于诊断2-HG相关肾细胞癌，并评估疗效，监测疾病进展与复发情况。抑制肿瘤代谢物产生的相关基因药物异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)1或2抑制剂可降低2-HG水平，逆转DNA或组蛋白高甲基化特征。2017年，美国FDA批准IDH2抑制剂恩西地平(enasidenib，AG-221)用于治疗复发或难治性IDH2基因突变急性髓系白血病患者，这也是美国FDA批准的第1个针对肿瘤代谢的抗癌药物。在指导术中决策方面，Santagata等[6]提出在IDH1基因突变神经胶质瘤中，2-HG水平与肿瘤细胞含量呈正相关，使用电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)-质谱技术检测术中活组织检查(简称活检)组织中2-HG水平，可推测肿瘤细胞含量，以帮助确定肿瘤切缘等术中决策。以上成功的研究案例表明，代谢物在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，发现并充分利用这些代谢物的改变，可有效指导肿瘤的诊断、疾病监测、靶向治疗、术中决策及预后判断等。同样，上述实践得出的研究思路亦适用于研究代谢较为旺盛的肝胆胰系统的恶性肿瘤。

2 肝胆胰恶性肿瘤中代谢物的研究

肝脏与胰腺代谢相对旺盛，因而肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)和胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)组织相对正常组织具有更显著的、与肿瘤发生和发展关系更密切的代谢改变，提示了代谢研究在HCC和PDAC等实体瘤中具有广阔的应用前景，也从侧面为胆道系统恶性肿瘤的代谢研究指明了方向。

2.1 HCC和PDAC的代谢物研究病毒性肝炎、肝硬化是导致HCC的高危因素。研究[7]发现，HCC患者合并代谢紊乱(主要涉及血清有机酸、磷脂、游离脂肪酸和胆汁酸水平的改变)的比例较肝硬化患者及健康个体显著增高。因此，代谢物检测在HCC中兼有早期诊断与鉴别诊断的价值。其中，豆肝素琥珀酸的检测可有效鉴别HCC与肝硬化。HCC患者机体内参与鞘脂代谢和磷脂分解代谢的血清代谢物水平显著高于肝硬化患者，故HCC患者的甘胆酸水平较高[8]。与慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的肝硬化患者相比，HCC患者血清中γ-谷氨酰基二肽水平显著升高。Chang等[9]研究发现，载脂蛋白C-Ⅲ和血清淀粉样蛋白P是HCC良好预后的生物标志物；载脂蛋白C-Ⅲ是调节三酰基甘油脂蛋白和高密度脂蛋白的关键成分；而血清淀粉样蛋白P是肝脏产生的急性期反应物，可激活经典补体途径。这些指标一定程度上反映了肝脏脂质代谢和免疫激活的能力。

PDAC具有致密的间质，占瘤体体积的90%以上，这使血管难以在瘤体中生成，血供的匮乏是PDAC组织缺氧及营养缺乏的重要原因。在此条件下，癌细胞通过合成代谢途径增加营养获取，这导致PDAC细胞中糖酵解和葡萄糖运输增加，谷氨酰胺消耗量升高，以保证脂质和氨基酸生物合成，维持氧化还原稳态。此外，肿瘤细胞成分通过自噬将大分子复合物和细胞器降解为代谢物以完成细胞内物质的循环利用[10]。以上代谢改变与PDAC化学治疗(简称化疗)耐药的关系逐渐受到学者关注，进而被揭示，目前已有多种代谢物类药物进入临床研究，如2-脱氧葡萄糖(2-DG)、1-甲基-D-色氨酸(Indoximod)等[11]。代谢组学分析可为寻找诊断及预测患者生存情况的生物标志物提供依据。Mayerle等[12]研究了914例PDAC、慢性胰腺炎、肝硬化患者，以及健康和非胰腺疾病对照者的血清及血浆代谢谱，建立了9种血浆代谢物联合CA19-9鉴别诊断PDAC与慢性胰腺炎的模型，阴性预测值达0.999。Karasinska等[13]分析了根据代谢基因区分的4种代谢亚型(稳定型、糖酵解型、胆固醇生成型和混合型)PDAC与预后的相关性，结果发现糖酵解型PDAC与患者较短中位生存期相关，其中胆固醇生成型PDAC患者的中位生存期最长。

2.2 胆道系统恶性肿瘤的代谢物研究代谢重编程及代谢物在胆道系统恶性肿瘤中的研究较少。代谢性疾病如肥胖、糖尿病等是胆道系统恶性肿瘤的危险因素之一，因此关于胆道肿瘤的代谢研究已逐渐成为学者关注的领域。与PDAC一样，胆道系统恶性肿瘤也具有致密间质成分，肿瘤内新生血管不丰富，亦存在糖酵解和葡萄糖运输增加、谷氨酰胺消耗量升高等代谢改变。有学者检测并比较了肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)与良性狭窄的胆管中的胆汁成分，结果显示ECC胆汁中还原性谷胱甘肽(GSH)、过氧化物、亚铁离子、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)明显减少[14]。口服药物α-山竹素可靶向AMPK/SREBP1途径抑制脂质合成，从而增强胆囊癌(gall bladder carcinoma，GBC)对吉西他滨的化疗敏感性[15]，表明脂质代谢在GBC对化疗敏感性的调控中发挥重要作用。ICC在胆道系统恶性肿瘤中的位置特殊，常发生于肝脏中，肝脏疾病如病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化等是ICC发生的危险因素；肝脏亦是糖、脂、胆汁酸代谢旺盛的器官，以上肝脏疾病往往伴随着肝脏代谢异常，这可能是ICC发生的“推手”，因此ICC受代谢影响可能更为显著，相关患者体液及肿瘤组织代谢改变较GBC、ECC有较大差别。

2.3 ICC的代谢重编程代谢重编程是恶性肿瘤的一个重要特征，包括ICC在内，几乎所有恶性肿瘤细胞均有不同程度、不同种类的代谢调控异常。代谢重编程是恶性肿瘤的共性，但不同肿瘤因其细胞起源、分化特点及发病部位的环境差异而具有不同的异常代谢特征。即便对于ICC这一种肿瘤，不同病因下，不同肿瘤驱动因素所致ICC的代谢改变也可能存在差异[16]。正确识别ICC特征性代谢改变，可为肿瘤诊断及治疗提供方向。ICC有氧糖酵解增强，表现在糖酵解相关酶的表达异常增多或结构改变。在肝吸虫相关的ICC中己糖激酶(hexokinase，HK)水平异常升高[17]。有研究[18]发现，胆管癌患者血浆及胆汁中丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKM)二聚体水平均高于对照组，PKM2高表达与胆管癌不良预后相关。IDH1或2基因突变是ICC的特征性突变，全外显子组测序结果发现近20%的ICC患者携带该突变[19]。ICC能量来源可能主要依赖有氧糖酵解和谷氨酰胺代谢，研究[20]发现，胆管癌细胞对谷氨酰胺需求量较高，细胞中常常存在谷氨酰胺的耗竭，环境中缺乏谷氨酰胺会显著影响胆管癌细胞的增殖，同时谷氨酰胺含量与胆管癌化疗耐药密切相关。在脂质代谢方面，本团队前期研究[21]发现，ICC中脂质代谢物前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)含量较高，与肿瘤侵袭能力相关。基于ICC存在代谢重编程，笔者认为以发现特异性代谢物改变或靶向代谢物的治疗为切入点，是解决ICC早期发现困难、对放射治疗(简称放疗)或化疗不敏感等问题的有效手段。

3 代谢物在ICC诊治及预后判断中的作用

3.1 代谢物检测在ICC早期诊断中的应用前景目前，ICC的诊断较困难，需结合血清学肿瘤标志物、影像学及病理学检查，且其难以被早期发现，故寻找早期诊断与鉴别诊断ICC的特异性生物标志物至关重要。代谢物不仅是基因和蛋白质表达的最终产物，也是基因组与内部环境相互作用的结果，循环代谢物的变化可能较准确地反映了癌细胞代谢表型的改变，因此分析ICC患者体液(全血、血清、血浆、胆汁或尿液)中的低分子量代谢产物是一种有前景的诊断方法。

Kim等[22]对比检测了87例ICC患者和150名健康对照者血清代谢物，发现2种差异表达的代谢物：N-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺(N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide，2PY)在ICC患者血清中含量约为健康者的2倍，溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)16∶0在ICC患者血清中的含量则显著减少;进一步比较发现，血清中含低水平2PY与高水平LPC 16∶0的ICC患者无病生存期更长。Banales等[8]对ICC、HCC、原发性硬化性胆管炎(PSC)患者和健康人群(每组20例)血清脂质和氨基酸水平进行分析研究，发现了9种用于检测ICC的具有高AUC、高灵敏度和特异度的代谢物[甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid, GCDCA)、甘氨胆酸(glychocolic acid，GCA)、硫酸雄酮(androsterone，sulfate)、硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS)、胆固醇酯(cholesteryl ester，ChoE)22∶6、ChoE 20∶4、单己糖神经酰胺(monohexosylceramide，CMH)d18∶1/16∶0、卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)16∶0/16∶0、鞘磷脂(sphingomyelin，SM)d18∶2/20∶0]，并进行了验证，显示上述代谢物的AUC均高于CA19-9。同时，将广义线性模型应用于鉴别ICC与HCC、ICC与PSC，该模型结合甘氨酸、天冬氨酸、SM 42∶3和SM 43∶2的算法可以鉴别ICC与HCC，其AUC为0.89，灵敏度为0.75，特异度为0.90；由PC 34∶3和组氨酸组成的算法能够准确区分PSC和ICC，其AUC为0.99,灵敏度为1.00,特异度为0.70,准确性为85%。以上结果均在验证集中得到了成功验证。

除了血清代谢指标外，Haznadar等[23]分析了尿液中4种代谢物：肌酸核苷(creatine riboside，CR)、N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，NANA)、皮质醇和尿液中一种标记为561+的脂质分子。利用ROC曲线分析评估4种代谢物对ICC的诊断能力，发现4种代谢物的诊断价值均优于CA19-9(AUC分别为0.81和 0.77)。4种代谢物与CA19-9联合应用显著提升了对ICC的诊断能力，具有较高的灵敏度(0.71)、特异度(0.92)、阳性预测值(0.89)和阴性预测值(0.78)，这4种代谢物可作为CA19-9的辅助检测指标。ICC可能伴随胆汁酸代谢的异常，血液及粪便中胆汁酸相对含量的检测具有一定临床应用价值。有研究[24]显示，ICC患者牛磺脱氧胆酸(taurodeoxycholic acid，TUDCA)和甘熊胆酸(glycoursocholic acid，GUTCA)的血-粪比(plasma-stool ratio，PSR)均显著高于HCC、肝硬化及健康者，并通过ROC曲线验证了TUDCA-PSR和GUTCA-PSR的诊断价值。以上结果初步显示了小分子代谢物作为ICC早期诊断标志物之一的可行性，但考虑到血清中小分子代谢物相比传统肿瘤标志物更易受机体基础疾病、营养状况、应激、肿瘤进展阶段等因素影响而产生较大波动的问题，各代谢组学研究所得结论并不一致。联合临床应用的肿瘤标志物与小分子代谢物可作为提升ICC早期诊断准确性的方式之一，期望未来能在ICC患者体液中发现稳定且有更高诊断灵敏度与特异度的肿瘤代谢标志物。

3.2 代谢物检测在ICC治疗中的作用代谢重编程发生在肿瘤发生、发展的各个阶段，与抗肿瘤药物的治疗敏感性关系密切。近年来，不少研究发现肿瘤耐药时代谢谱发生了明显的改变，因此有望通过靶向特征性的代谢改变逆转耐药。Sounni等[25]通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析发现，在抗血管生成药物舒尼替尼或索拉非尼治疗停药期间，血管再生恢复伴随乳酸生成和脂质合成增强，这种代谢变化与肿瘤转移能力增强有关。脂质合成抑制药物奥司利他可以抑制舒尼替尼停药后肿瘤的复发和转移。肿瘤脂代谢环境对肿瘤的治疗效果亦具有显著影响；研究[26]发现，周围脂肪组织丰富的肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肝癌，往往表现出对抗血管生成治疗的耐药性，而阻断脂质合成可以抑制肿瘤转移及耐药性的产生。作为维持细胞稳态的重要氨基酸，谷氨酰胺的缺乏可减轻缺氧诱导的胆管癌对化疗的耐药[20]。胱氨酸/谷氨酸反向转体抑制剂柳氮磺吡啶可通过改变细胞色氨酸降解通路增强顺铂对胆管癌的治疗效果[27]。这些研究证据表明，胆管癌细胞内外环境中氨基酸水平均能显著影响其对化疗药物的敏感性。

与正常组织相比，ICC代谢表型有明显改变。从癌前病变发展成局部浸润至转移的过程中，ICC代谢表型及代谢依赖性也发生改变。研究ICC生存环境及细胞自身代谢改变与治疗敏感性的关系有助于从代谢角度发现有效的ICC治疗方案。

3.3 代谢物检测在ICC预后判断中的作用代谢物的变化往往由整体稳态失调造成，在此情况下，机体对异常增殖的肿瘤细胞的监督、杀伤能力减弱，导致患者肿瘤恶性进展及不良预后。通过无创手段检测循环代谢物可知悉机体是否存在稳态失调，从而判断肿瘤是否具有恶性进展趋势，预测患者生存情况。目前，ICC诊断常用的血清学标志物CA19-9、CEA等是预测患者预后的主要指标，CA19-9水平与ICC患者生存时间呈负相关。近期，Teeravirote等[28]利用植物凝集素检测发现了一种新的多糖类生物标志物紫铆凝集素(BMA)结合N-乙酰半乳糖胺/半乳糖相关聚糖(BMAG)，其仅能在胆管癌患者血清中被检测发现，但诊断灵敏度(0.554)较低。当血清BMAG≥82.5 AU/mL时，患者肿瘤分期欠佳，生存时间显著缩短。而关于ICC患者外周血胆汁酸、细胞因子和组胺的研究[24]发现，3类代谢物中，血浆TUDCA水平与ICC患者生存时间呈负相关。Uchida等[29]采用分光光度法检测血清活性氧代谢物(reactive oxygen metabolite，ROM)水平，发现血清高水平ROM与胆管癌不良预后相关，这与患者机体氧化应激平衡失调有关。除了以上循环代谢物被发现与ICC患者预后相关外，某些功能性蛋白质也能够被检测到与ICC患者预后相关。血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂A 5(serine protease inhibitor A 5，SERPINA5)主要在肝脏合成，是一种多功能的肿瘤抑制因子，具有通过破坏纤连蛋白整合素信号通路抑制肝癌细胞转移的特性。高水平血浆SERPINA5与胆管癌患者5年生存率相关，且随着胆管癌分期的进展，其水平逐渐降低[9]。体液功能性蛋白质或代谢物水平或类型均能一定程度反映患者机体或局部器官状况，以此推测ICC的发展趋势、进展速度及患者预后。

4 ICC与机体代谢间的相互影响及动态变化

4.1 机体代谢紊乱导致ICC发生及不良预后研究显示，代谢性疾病与ICC发病风险升高显著相关，同时代谢性疾病可能导致ICC患者不良预后。Ⅱ型糖尿病患者处于高胰岛素状态，ICC细胞胰岛素样生长因子-1和胰岛素受体水平升高，持续的胰岛素刺激能促进ICC细胞增殖。肥胖患者脂肪细胞分泌较多脂肪因子，包括瘦素、脂联素(adiponectin，APN)和促炎分子。研究[30]证据表明，瘦素和IL-6、TNF-α能够促进ICC发生，这说明机体代谢紊乱引起的体液代谢物变化可能是ICC的危险因素。组织中某些代谢物的积累同样可能导致肿瘤的发生，已有研究[4]证实，延胡索酸、琥珀酸、2-HG等异常积累能够导致肾脏肿瘤发生，同时与患者不良预后相关。亦有研究[4]证实，在高血糖小鼠的脂肪组织中存在延胡索酸积累，急性缺血预处理可导致小鼠心肌2-HG积累，脂多糖诱导的巨噬细胞激活会导致琥珀酸积累。因此，除基因突变外，肥胖、糖尿病、缺血缺氧、感染等可能是这些代谢物异常积累的诱因。

4.2 ICC对机体代谢的影响研究[31]结果显示，部分肿瘤患者可并发糖尿病，PDAC患者由于胰腺β细胞功能被破坏导致胰岛素缺乏，胰腺切除术后的并发症导致胰腺体积减小，或应用皮质类固醇、化疗药物等促进糖尿病的发生。除PDAC外，包括ICC在内的多种恶性肿瘤也会增高糖尿病的发生风险[32]，但化疗及糖皮质激素使用等治疗因素是诱发糖尿病的主要原因，鲜见肿瘤本身导致糖尿病的报道。目前尚无充足证据证明ICC可导致机体代谢紊乱，但如前所述，ICC肿瘤组织及患者体液中存在糖、脂、氨基酸、胆汁酸等代谢物含量或比例异常，这表明ICC代谢重编程会对机体及局部组织代谢产生一定影响。

4.3 ICC患者机体及肿瘤微环境代谢处于动态变化 ICC肿瘤微环境及患者体液中糖、脂、氨基酸等代谢物异常与其治疗效果及预后相关，这些代谢物异常既是ICC本身代谢重编程及组织病理学改变的结果，又是ICC诊断及预后的标志物，并为影响ICC药物敏感性的重要因素。因此，ICC在发生、发展过程中与机体及微环境相互影响，同时这也是一个动态变化的过程，ICC发展过程的不同阶段其代谢表型均发生改变。肿瘤生长早期需要吸收营养物质完成生物合成，局部浸润期则出现选择性代谢需求，进展后期尤其是转移期因治疗而出现新的代谢表型。因此，肿瘤代谢表型受机体、肿瘤微环境及肿瘤进展影响存在极大不稳定性及动态变化性，是目前尚无新型代谢物用于ICC临床诊治及判断预后的重要原因。