聚类肽的合成方法及性能研究进展*

2022-07-29王筑城魏玉函王存国

化工科技 2022年2期

王筑城，魏玉函，王存国

(青岛科技大学橡塑材料与工程教育部重点实验室山东省橡塑材料与工程重点实验室，山东青岛 266042)

近年来，随着合成技术不断创新发展，人们对环状聚合物的研究从原先的环状聚合物材料的基本性质和理论模型的构建开始转向功能性环状聚合物的合成，聚类肽又称氮取代聚甘氨酸(N-Polyglycine)就是其中之一。对聚类肽研究最早的是Kukula等[1]科学家，早在1926年，率先对聚N-甲基甘氨酸(Poly N-methylglycine，PNG)进行了研究，发现其存在于人体肌肉等部位，并发现了肌氨酸(Sarcosine N-carboxyanhydride，SNCA)在氮原子上缺少氢原子的情况下仍然会在吡啶作用下发生聚合等现象。1950年，Sun等[2]在上述研究基础上有重大突破，合成出了一种易水解且取代基不同的N-羧酸酸酐(N-carboxylic anhydride，NCA)；1956年，Zhang等[3]发现了聚肌氨酸(PSar)的免疫原性极小的特点，从而开始了聚类肽的研究。21世纪初，PSar被合成出来，并开始应用于生物医学方面[4]，而且Kuemin等[5]研究了Sar-NCA的合成机理，并探索出了用固相法合成聚类肽的实验路线。

1 聚类肽的结构

聚类肽结构可以通过键与侧基二级空间结构的相互改变形成稳定的一级空间结构,与一般聚肽通过键与氢键相互作用形成二级空间结构不同,这是由于聚类肽没有氢键相互作用决定的。经过大量研究，了解到聚类肽PSar和其他非类似手性侧基的两类聚类肽同样会表现出一种无规线性基团构象，具有类似手性侧基的聚类肽，如聚脯氨酸，有PPⅠ和PPⅡ2种螺旋构象。只要直接在这类聚类肽侧链引入手性基团，便得到类似的螺旋构象。Guo等[6]利用R-NCA的开环聚合得到了许多手性基团为侧基的环状和线性聚类肽，通过测试得知二者都具有螺旋结构(见图1)。

图1 PPⅠ和PPⅡ2种螺旋构象

2 聚类肽的合成方法

2.1 固相合成法

聚类肽的固相合成法由Dewey首先提出[7](见图2)，具体步骤是在固定支架的肽链上加入含有氨基保护能力的氨基酸基团制备规整序列的肽链。一些纳米管状材料由该方法制备，但操作步骤繁琐，所需试剂昂贵，并且合成的肽键长度也有局限。1992年，Simon等[8]提出了另一种亚单体合成法，简化了制备规整肽链的固相合成所需要的复杂步骤，使用该方法不仅提高了合成效率而且同时获得了调控聚类肽序列的能力。亚单体合成法的合成过程(见图3)分为两步。(1)溴乙酸分子在N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)的作用下，与承载溴乙酸的树脂载体末端的仲胺发生酰化反应；(2)位于树脂载体内部末端的一个溴原子与伯胺发生SN 2亲核取代反应，使树脂载体末端再次转化为仲胺，继续与溴乙酸发生乙酰化反应。不断重复上述2个过程可得到不同序列的类肽材料。

图2 亚单体序列可控聚类肽的固相合成法

图3 聚类肽亚单体固相合成法

2.2 开环聚合法

开环聚合法一般是指将NCA单体通过开环进行聚合的方法(见图4)，NCA开环聚合是目前合成大量聚类肽材料所使用的一种主要方法，具体是先合成开环聚合所用的原材料NCA，然后环状NCA再进行开环聚合。开环聚合法具有合成操作简便、合成产物产率高、可控性好等优点，可以得到高分子量和窄分布的聚合物。1906年，Aubert首先合成了NCA[9]，后来，Bailey等[10]相继合成出了高分子量的聚肽，从而引起了NCA的合成技术热潮。时至今日，NCA已经发展衍生出了嵌段、枝状、星型等多种拓扑结构，借助红外光谱(FTIR)、差热分析(DSC)和显微镜等测试方法，使人们对NCA合成多肽的合成机理和催化体系有了更深的认识。

图4 R-NCA的开环聚合

Zhang等[11]用引发剂NCA制备了环状均聚和嵌段的聚类肽，并且研究了其聚合机理和物理性能。Luxenhofer与其同事使用固相载体引发开环聚合氮取代的NCA，并且研究了产物的溶解性、热性能和生物相容性。因NCA五元环上有氢键供体(—NH—)存在，NCA极易吸收空气中的水分而变得不稳定。并且，NCA在聚合过程中会产生使分子量分布(PDI)变宽的副反应。在过去很长一段时间内，金属硅酸盐和金属氧化物一直是主要的NCA合成所使用的催化剂和引发剂，并在引发酸酐聚合时发挥“碱催化”机理，作主催化剂进行聚合时要具备特定的干燥或真空环境，这意味着催化剂对反应条件的要求很高，必须在无水无氧的条件下进行，且含有的金属物质会对之后的提纯和生物医药方面的应用造成不利影响。Tao等[12]提出了一种使用伯胺作为引发剂引发NCA聚合的方法，得到分散性低、产率高的聚合物，但缺点是以此为催化剂的反应速度较慢。之后，Hadjichristidis[13]提出使用伯胺作为引发剂，利用真空技术实现聚合，以此减少链转移终止等影响，但真空条件要求十分苛刻，实用性较差。

自从20纪初首次合成了NCA，进行了大量的研究，发现可以采取选择含有烷氧羰基的氨基酸与部分卤化试剂反应或使用α-氨基酸与光气混合后的聚合反应(Fuchs-Farthing法)合成NCA。但由于光气的毒性和污染性很强，而且光气的储存和控制对环境条件要求很苛刻，逐渐开始使用双光气和三光气来替代，从而达到降低毒性的目的。目前，比较多的合成NCA的方法主要是采用侧基被保护的氨基酸与二、三光气在四氢呋喃(THF)中同时进行反应，制备具有氮-羧基结构的环内羧酐。该方法也有不少缺陷，最严重的是在NCA的合成过程中会有很多副产物产生，如盐酸、氨基酸盐酸盐和异氰酸基酰氯等物质，这些副产物会抑制甚至终止NCA的链增长，从而对NCA的聚合过程产生很多不利影响。目前，NCA的纯化方法比较统一，公认采用重结晶的方法，如果制备少量的NCA，不采用重结晶法而用柱层分析法，同样可以达到提纯效果，即采用不同的氨基酸在不同溶剂中加入引发剂或催化剂方法，引发NCA开环聚合，进而制备聚类肽材料。这种方法节约成本，可以控制分子量分布，而且分子的手性中心消旋化现象大幅度减少，便于聚氨基酸的合成与制备，但该方法合成的聚类肽也有缺陷，会导致分子序列特异性的减少和多肽单分散性的降低。

3 聚类肽的性能

聚类肽性能中比较重要的是聚类肽在溶剂中的溶解性，由于聚类肽分子结构中氮原子上的氢被其他基团取代，分子链间氢键的相互作用将不复存在，从而使聚类肽的溶解性得到大幅度提高。

Birke等[14]进一步研究了碳原子数不同的烷基链取代基聚类肽的性能，测试聚类肽在不同烷基链取代后在溶剂中溶解性的变化。PSar可以看作是以1个碳原子作为取代基的聚类肽，有着很好的水溶解性，而且还发现PSar水溶解能力的上限无法被测得，甚至可以与水在一些特定条件下以任意比例互溶。碳原子数增多后，以2个碳原子为侧基取代基的聚N-乙基甘氨酸(PNEG)的水溶性就会下降。当碳原子增多到3个[即聚N-丙基甘氨酸(PNPG)]，以3个碳原子为侧链，其水溶性更是远远不如上述2种物质。当碳原子数增至4个，以4个碳原子为侧链的聚N-丁基甘氨酸(PNBG)则完全不溶于水，该团队还测定了上述提及的聚类肽在其他溶剂中的溶解性。由此可见，随氮原子上取代基的不同，聚类肽由于结构上的差异会表现出不同的溶解性。PSar只可以溶解在极性很强的溶剂中，随着侧链的结构变化，聚类肽在极性一般的溶剂中也有了较好的溶解性。

由于从聚类肽结构中发现氮原子上没有氢存在，所以聚类肽无法形成类似多肽的在氢键相互作用下的二级结构。但聚类肽也有许多长处，如聚类肽的侧基可以被修饰，可以通过改变空间构型，使其形成同样稳定的二级结构。PSar在水溶液中的溶解性十分优良，并且结构会呈现出无规线团构象。其结构不同的原因是因为酰胺键存在着顺反异构现象。因此，由以上可以推测出如果在侧基引入手性基团结构，可能也会形成和上文类似的螺旋结构。目前，对聚类肽的研究还处于起步阶段，对PSar之外的材料的了解还不是很深刻，聚类肽的很多基本性质还有待进一步探究。

3.1 聚类肽的溶解性

溶解性是材料最重要的性质之一，对作为可以应用在生物医用方面的聚类肽来说就显得更加重要。因为聚类肽结构中没有氢键作用，所以聚类肽在绝大部分溶剂中的溶解性都远好于聚肽。例如作为聚肽的谷甘氨酸的溶解性非常差，但作为聚类肽的PSar却能够很好地溶解在水和绝大多数极性溶剂中。

Song等[15]研究了不同长度侧链的聚类肽在溶剂中的溶解性，其中PSar的水溶性十分出色，甚至无法测量出其在水中的溶解极限。但是随着基团侧链长度的变长，水溶性却逐渐变差，例如聚乙基甘氨酸的水溶性还比较好，聚丙基甘氨酸的溶解性就较差，至于聚丁基甘氨酸则完全不溶于水。对于聚类肽在一些有机溶剂中的溶解性，研究发现取代基上有氮原子时，聚类肽在不同有机溶剂中的溶解性相差很大，例如PNEG可以溶解在绝大部分有机溶剂中，PSar可以溶解在强极性溶剂中，而PNBG只有在氯仿之中才能溶解。

3.2 聚类肽的抗菌性能

近年来，用于抵抗病菌的抗菌肽(Amtimicrobial Peptides,AMPs)越来越受到关注，抗菌肽是可以从生物体内找到并提取出来的聚类肽，这意味着其生物相容性十分优异，加之抗菌能力，使其越来越受到重视。但AMPs也有着诸如在生物体内利用率低、结构稳定性差及结构在循环时容易发生分解等缺点，从而限制了其在生物医学领域中的应用[16]。聚类肽与AMPs的分子结构类似，主链结构相同，并且具有比AMPs高得多的稳定性，同时还兼有AMPs的优点，比如广谱抗菌性和抗耐药性等。

2008年，Huang等[17]发现了一种含有阳离子的抗菌聚类肽，该聚类肽分子具有螺旋结构，这使得该抗菌肽的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)和细胞毒性远低于一般聚类肽。2012年，Mojsoska等[18]报道了一种类似环状抗菌聚类肽，抗菌性能优异，还证明了具有螺旋结构的环状类肽的抗菌性能优于不具有螺旋结构呈线形的类肽分子。2015年，Statz等[19]合成了20种含阳离子的抗菌型聚类肽分子，并系统性地研究了抗菌型聚类肽分子结构，以及结构中电荷分布对于聚类肽抗菌性能的影响。

3.3 聚类肽的温敏性

Zhang等[20]在2012年首先制备出了具有温度敏感性能的聚N-乙基甘氨酸-r-N-丁基甘氨酸，同时发现了该聚类肽在水溶液中有着可逆相转变行为和临界溶解温度行为(LCST)，并通过进一步研究发现聚类肽的结构和聚合物浓度以及盐离子都会对温敏性产生影响；在其他结构环境相同的条件下，环形结构聚类肽比线型结构聚类肽的温敏性要低很多，并且还可以通过调节聚合物的组成和利用盐溶和盐析作用改变温敏性，值得注意的是，物质的分子量却对温敏性影响很小。

然而，Robinson等[21]却提出了相反的意见，分析了诸如PNPG、聚N-烯丙基甘氨酸(PNAG)、聚N-异丙基甘氨酸(PNIPG)等一系列聚合物，得出了与以上相反的结论，即其分子量会对聚类肽温敏性能产生很大影响。制得了一种聚肌氨酸-b-聚N-癸基甘氨酸(PSar-b-PNDG)，可以通过改变结晶度改变温敏性的凝胶。这种以PSar-b-PNDG为基体的材料在室温下的甲醇溶液中是以凝胶状态存在，随着温度的升高，会逐渐溶解，当温度从高温降低至室温时，溶解的物质又能转变为凝胶。由此证明了PNDG具有结晶性，室温时PNDG处于晶态，但晶区会随着温度升高而溶化，就会观察到凝胶-溶胶转变。

3.4 聚类肽表面防污性

表面防污性是生物材料的重要特性之一，一般采用在材料的表面上进行修饰提高表面防污性，也可以利用材料表面修饰防止表面吸附蛋白质等物质，从而减少细胞的非特异性黏附。Stayz等[22]首先使用了多巴胺衍生物将材料表面附着上聚类肽，从而研究聚类肽的防污性。先期使用寡聚N-甲氧乙基甘氨酸进行实验，结果较为理想，聚类肽表面防污的有效性可以持续约半年；但当对不同侧链结构的聚类肽进行测试时，不同侧链结构的聚类肽的防污性很差。另外，还研究了聚类肽材料在蛋白质表面上的占比和聚类肽的聚合度对聚类肽防污性是否有影响，得出的结论是只有拥有一定数量重复单元的聚类肽才会有表面防污性。

3.5 聚类肽的生物相容性

由于聚类肽常被用在生物医药领域，所以对生物相容性要求较高。聚类肽与聚肽性质相似，其生物相容性也较好。Li等[23]对聚类肽的生物相容性进行了大量研究，发现了聚类肽能够抑制抗原在生物体内的免疫性应答，自身能够在生物体内稳定存在；另外还研究了聚类肽的生物毒性，通过将人体细胞放在聚类肽中培养后成功存活，证明聚类肽有着极低的生物毒性。

3.6 聚类肽的自组装

自组装广义上是指高分子与高分子间、高分子与小分子间或高分子与基底间产生的相互作用，依靠非共价键合而实现不同结构的现象。自组装的另一种说法是组装单元在氢键、静电相互作用或者在范德华力等弱共价键作用下，自动形成特定结构的过程。生物体内的自组装现象十分普遍，是构成各式各样生命体的基础。高分子材料的自组装自20世纪中叶以来就越来越受到人们的广泛关注，相关研究也愈发成熟，并取得了很多突破，自组装已经成为制备具有规整结构、功能性纳米材料的主要手段。目前，涉及到的自组装主要有两亲性嵌段共聚物的自组装等。

聚类肽具有和蛋白质相似的结构特征，也和蛋白质一样有结构可调控性，这意味着可以使用聚类肽制备功能化超分子组装体，具有重要意义。Olivier等[24]合成了同时含有正电和负电基团的聚类肽分子，而且这些分子有着不同疏水基团序列，并使用这些聚类肽分子在水溶液中制备出了厚度仅为几纳米的超薄纳米片结构，又通过Langmuir-Blodgett film(LB)膜分析仪器研究了聚类肽自组装过程。

Lahasky等[25]采用开环聚合方法制备了基于PSar的两嵌段共聚类肽，在水溶液中制备了球形和圆柱形胶束，并且进一步研究了时间对胶束形貌有无影响，发现静电和分子内氢键的相互作用会对超螺旋结构的形成有重要影响。

自组装的主要影响因素有聚合物的分子量、结晶性、溶液种类及溶液浓度等。另外，外界环境的变化也会对自组装产生影响。比如外界温度、湿度和光强等。聚类肽的自组装动力主要依靠聚类肽主链里的酰胺结构产生的偶极相互作用。在对自组装行为的探索过程中，发现许多共聚物都可以作为自组装单元形成各种各样的稳定结构，为自组装的发展开辟了新途径，比如氢键诱导大分子自组装、静电作用诱导大分子自组装、刚性链诱导大分子自组装、外界条件诱导大分子自组装和结晶驱动自组装等。