呕吐毒素对HK2 细胞增殖及诱导凋亡蛋白表达的调节作用

张百刚，李金亮，梁海荣，黄橙辉，徐冬梅

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050）

呕吐毒素（vomitoxin）是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）的别称。20 世纪70 年代是由Yoshizawa 等[1,2]在镰刀菌污染的小麦和禾谷类食物中发现并鉴定出来的，它的化合物种类属单端孢霉烯B 族类化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生[3]。DON 的化学名为3a,7a,l5-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，是最常见的霉菌毒素之一。人和动物摄入含DON 的谷物食品会引起一系列中毒反应，例如腹胀、头昏、呕吐等一系列的不良反应[4]。研究者发现高剂量的DON 可对动物机体的免疫系统产生明显的急、慢性毒性作用。研究表明，急性染毒DON 可导致小鼠肝、肾、脾、胸腺的细胞损伤[5]，并会诱导免疫细胞的凋亡，抑制其增殖作用[6]。国内外大量研究发现DON 过量摄入可引起细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性[7,8]。虽然DON 的致癌性是不确定的，但对人体来说具有潜在的危险性[9]。DON 的细胞毒性，在人体很多细胞系中被研究[10]，研究表明在人肝癌细胞株（HepG2)中证明了DON 对人体细胞产生了明显的毒性，主要表现为DON 可以抑制细胞的增殖，导致细胞存活率的降低，并且会诱发细胞氧化还原系统的损伤[11]。

随着人们对食品安全的愈加重视，人们对所食用的谷物及其制品的要求越来越严格，目前世界很多国家制定了DON 的限量标准[12]，国际癌症研究机构发布数据，DON 已被列为三类致癌物。美国食品及药品管理局规定DON 的含量为1 mg/kg 是其安全标准范围。我国食品药品管理局规定小麦和谷物类DON 的含量要求小于5000 μg/kg[13]。然而，超过此限量会产生一定的危害，所以研究DON 的毒性作用与毒性机制，对保护食品安全和人类健康具有重要意义。虽然研究者对DON 细胞毒性做了很多研究工作，但是对其引起人肾细胞毒性的研究还很少。本研究通过探讨DON 对人肾小管上皮细胞HK2 的增殖作用和凋亡蛋白表达的作用机制，对进一步阐明呕吐毒素的细胞毒性提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及试验试剂

HK2 细胞株购自兰州大学口腔医学院储存库；DON（白色粉末、纯度≥95%）购自阿拉丁生物试剂；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司；DMEM 培养基购自上海源培生物股份有限公司；青霉素和链霉素溶液以及PBS 溶液购自北京Solarbio 公司；Hoechst 33328 染色液购自南京建成生物试剂；流式细胞术试剂购自美国Becton Dickinson公司；Bax、bcl-2、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9 单克隆抗体均购自美国Proteintech 公司；牛血清白蛋白（BSA）和Triton X.100购自上海Beyotime 公司；LDH 试剂盒、Western 及IP细胞裂解液均购自碧云天公司；LDH 试剂盒碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG（H+L）均购自碧云天公司。

1.1.2 实验仪器

MCO-170AICL-PC CO2培养箱，普和希健康医疗器械有限公司；3-18KS 高速冷冻离心机，北京博劢行仪器有限公司；Infinite M Nano 多功能酶标仪，美国BIO-RAD 公司；CKX53+DP74 荧光倒置显微镜，上海剑凌信息科技有限公司；Beckman Altra 流式细胞仪，美国Beckman 公司；ChemiScope 6100 化学发光成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司；Mini 伯乐垂直电泳槽，美国Biorad 公司；Trans blot 伯乐湿式转移槽，美国Biorad 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

将HK2 细胞接种于培养瓶中，完全培养基（10%的胎牛血清:DMEM=1:9），在5% CO2，37 ℃条件下进行培养，待细胞生长至对数期时，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 HK2 细胞增殖试验

将100 μL（4×103cells/孔）HK2 细胞接种到96孔板中，待细胞生长至对数期时，分别加入浓度为0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱内培养24 h 后，向孔板中加入20 μL/孔的MTT，之后在孵育箱内继续培养4 h 后加入150 μL/孔DMSO 溶解液，放在摇床上缓慢摇动10 min 至紫色结晶溶解后，用酶标仪在490 nm 处测定吸光值。每组各设6 个复孔，实验平行3 次。

将100 μL（4×103cells/孔）HK2 细胞接种到96孔板中，待细胞生长至对数期时，加入终浓度为30 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱内分别培养0、12、24、48、72 和96 h 后，向孔板中加入20 μL/孔的MTT，之后在孵育箱内继续培养4 h 后加入150 μL/孔DMSO 溶解液，放在摇床上缓慢摇动10 min 至紫色结晶溶解后，用酶标仪在490 nm 处测定吸光值。每组各设6 个复孔，实验平行3 次。细胞存活率的计算公式如下：

式中：

W——细胞存活率，%；

M——给药组的OD 值；

M1——对照组的OD 值。

1.2.3 细胞凋亡形态检测

取对数生长期的HK2 细胞，分别加入浓度为0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱内培养24 h，然后加入4%的多聚甲醛300 μL，在室温下固定15 min。固定完成后，PBS溶液清洗2 次，在摇床上缓慢摇动10 min，重复3 次。室温避光条件下每孔加入300 μL Hoechst33328 染液，染色5 min。PBS 溶液清洗后，用抗荧光猝灭剂封片，片子避光保存，在荧光显微镜下观察拍照。

1.2.4 细胞凋亡率测定

取对数生长期的HK2 细胞，分别加入浓度为0、15、40 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱内培养24 h，将细胞培养液吸出，PBS 洗涤细胞1 次，加入适量的0.25%胰酶消化细胞，消化完成后吸出胰酶消化液，加入3 mL 新的完全培养基（DMEM:FBS=9:1）到离心管中，1000 g 离心5 min，弃上清，收集细胞。按照Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明进行细胞凋亡率检测。

1.2.5 细胞中LDH 的测定

取对数生长期的HK2 细胞接种到6 孔板/1000 μL，分别加入浓度为0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON，在37 ℃，含5% CO2的孵育箱内培养24 h，收集上清夜待测。按照试剂盒的说明，设置空白孔、标准孔、测定孔和对照孔进行实验，每组实验重复三次。

1.2.6 蛋白质印迹检测Bax、bcl-2、Caspase蛋白表达水平

取对数生长期的细胞，传代到细胞培养瓶中，待细胞生长24 h 后，用浓度为0、15、30 和40 μmol/L的DON 处理细胞24 h，收集细胞，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，按常规方法提取蛋白。SDS-PAGE电泳，10%分离胶，每孔上样50 μg 提取的细胞总蛋白，电泳完毕后经电转移至PVDF 膜上，室温封闭1 h。按适当比例加入一抗4 ℃摇床过夜，TBST 洗膜3 次，用TBST 按1:10000 比例稀释二抗，室温孵育1.5 h。用Image J 软件进行灰度分析。目的条带与内参条带的比值作为结果，各处理组样品与空白对照的比值表示蛋白水平。为了实验结果有可比性，对照组值设为l。

1.2.7 统计学处理方法

所有实验均重复三次，数据均以平均值±标准差（SE）表示。采用SPSS 18.0 统计软件进行单因素方差分析。p＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 DON 抑制HK2 细胞的增殖

不同浓度DON 对HK2 细胞的抑制作用如图1 所示，由图可知，DON 对HK2 细胞的生长具有抑制作用，且随着浓度增大抑制作用越强。15～80 μmol/L 的DON 对细胞的抑制率分别为61.82%、53.64%、42.43%、38.66%和36.54%；30 μmol/L 的DON 处理HK2 细胞0、12、24、48、72 和96 h 后,细胞的存活率分别为99.84%、80.51%、60.25%、52.22%、62.50%和71.34%。从细胞存活率可知，30 μmol/L 处理HK2细胞48 h 后细胞毒性达到最大；但72 h 后细胞的存活率又有所上升。以上结果表明，DON 对HK2 细胞的抑制作用有一定的量效关系[14]。

2.2 细胞形态的变化

由图2 的显微镜照片可看出，30 μmol/L 的DON可使HK2 细胞形态发生改变，与正常细胞相比，凋亡和死亡比例增大，说明DON 对细胞有毒性作用，并且造成细胞损伤。由图3 的荧光显微镜照片可看出，不同浓度DON 作用细胞后，对照组染色质均匀、无浓缩、边集现象，细胞染色均一，无明显亮蓝色。实验组核染色质明显聚集、固缩、并且有细胞核碎片，凋亡小体出现。当DON 浓度增大到40 μmol/L 时，细胞内出现凋亡和死亡的比例增大，当DON 浓度增大到80 μmol/L 时，细胞几乎全部凋亡或死亡。

2.3 细胞凋亡率的检测

由图4 可看出随着DON 浓度的增大，细胞凋亡率升高，DON 浓度为15 μmol/L 时，细胞凋亡率为2.30%，当DON 浓度增大到40 μmol/L 时，细胞凋亡率为30.20%，当DON 浓度增大到80 μmol/L 时，细胞凋亡率为53.50%。由此可说明，随着DON 浓度的增大，细胞凋亡率不断升高，DON 对HK2 细胞的凋亡有一定的促进作用。

2.4 细胞内LDH 的含量

由图5 可知，DON 对HK2 细胞内LDH 水平具有一定的影响。随着DON 浓度增大，细胞存活率不断下降，细胞毒性不断上升，细胞内LDH 水平不断下降。当DON 浓度为15 μmol/L 时，细胞内LDH 含量为对照组的73.50%。当DON 浓度为30 μmol/L 时，细胞内LDH 含量为对照组的61.50%。当DON 浓度为40 μmol/L 时，细胞内LDH 含量为对照组36.50%。当DON 浓度为60 μmol/L 时，细胞内LDH 含量为对照组的30.90%。当DON 浓度为80 μmol/L 时，细胞内LDH含量为对照组的18.20%。这就说明，随着DON浓度增大，细胞毒性不断提高，引起细胞发生了凋亡或坏死，结果造成了细胞膜结构的破坏，随后细胞浆内的LDH 释放到了培养液中。

2.5 DON 对HK2 细胞内蛋白表达的影响

2.5.1 不同浓度DON 处理HK2 细胞对Bax、bcl-2、NF-KB 蛋白表达的影响

图6 结果表明，Bax 蛋白随着药物浓度的增加而上调；bcl-2 和NF-KB 蛋白表达下调。bcl-2 是抗凋亡蛋白，可以抑制蛋白表达量的增加，与此相反，Bax是促凋亡蛋白，可以促进蛋白量的表达[15]。当细胞被死亡信号刺激后，相关蛋白酶作用于促凋亡蛋白，使其构象发生变化，引起细胞器各种功能的丧失，最终会引起细胞器的凋亡[16]。NF-kB 是一种有效的凋亡抑制剂，它会抑制蛋白与IkB 相结合，存在于胞质中[17]。TNF 诱导时，IkB 首先被磷酸化，然后被泛素降解。但是，NF-kB 二聚体被释放，并转移到细胞核中。这些表达产物能够抑制细胞的凋亡，从而达到抑制细胞凋亡的目的。在DON 加药诱导后，蛋白表达量增加，说明DON 激活了细胞内NF-kB 的表达，但是是否直接激活，还需要进一步研究。

2.5.2 不同浓度DON处理HK2细胞对Caspase家族蛋白表达的影响

Caspase 属于半胱氨酸蛋白水解酶的家族，它们各个成员的作用主要是引起细胞的凋亡[18]，但是在细胞凋亡的过程中它们扮演着不同的角色。Caspase 凋亡蛋白酶在凋亡过程中起着不同的作用，研究者将其家族分为两大类：始动Caspase 和执行Caspase，其中始动Caspase 包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9，执行Caspase 主要包括Caspase-3、Caspase-6。Caspase被激活后，作用于底物蛋白，使蛋白质分解，引起PCD，这类酶控制着PCD 的信号转导和实施过程。图7 结果表明，Caspase 凋亡蛋白都随着DON 浓度增加呈现表达量上调的趋势，其中Caspase-3 的变化极为明显，当DON 浓度为15 μmol/L 时，Caspase-3 蛋白表达量显著增加（p＜0.001）。当DON 浓度为30 μmol/L时，Caspase-3 蛋白表达量有一定的增加（p＜0.05）。当DON 浓度为40 μmol/L 时，Caspase-3 蛋白表达量具有上升趋势，无显著差异。Caspase-3 是它们成员中参与凋亡的关键酶之一，很多的细胞凋亡信号被其激活，使得细胞质、细胞核及其细胞骨架中的重要的蛋白酶失活[13]。

3 结论

呕吐毒素可显著抑制人肾小管上皮细胞HK2 的增殖作用，并呈现明显的时间-效应和剂量-效应关系。呕吐毒素会使HK2 细胞发生形态学的改变，进而诱导HK2 细胞发生凋亡，表现出明显的凋亡细胞特征。呕吐毒素引起了HK2 细胞内LDH 含量的变化，随着呕吐毒素浓度增大，细胞毒性不断提高，细胞发生了凋亡或坏死，结果造成了细胞膜结构的破坏。呕吐毒素会使HK2 细胞内凋亡蛋白表达水平发生改变，呕吐毒素可上调Bax、Caspase-2、3、6、8、9 蛋白表达，抑制了bcl-2 和NF-kB 的蛋白表达。