降血脂鼠李糖乳杆菌的筛选及其对高脂模型地鼠血脂的影响

曹蓝，白玉芹，余萍，汤纯，矫艳平*，闵祥博

（1.江西仁仁健康产业有限公司，江西樟树 331200）

（2.汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司，辽宁沈阳 110000）

血脂是血浆中的胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）等中性脂肪和类脂的总称，它是生存必须的代谢物质。血脂中TC 主要合成细胞浆膜、类固醇激素及胆汁酸，TG 主要参与体内能量代谢[1,2]。随着社会的进步，生活水平的逐渐提升，食品中营养的不断增加，饮食中摄入胆固醇食品也在增长，现如今高血脂症一跃成为威胁我国中老年人身体健康第一大隐患。关于高血脂引起的疾病逐渐增多，例如冠心病、心肌梗塞和动脉硬化等，此类疾病的发病率高，治愈率相对较低，因此需要正确的认识高血脂，并尽早进行预防[3-6]。高血脂症是指脂肪代谢或者运转异常使人体血液中的血脂含量超过正常范围，其中人体血清中胆固醇过高，甘油三酯过高，高密度脂蛋白胆固醇过低都是高血脂的重要指标[7-10]。虽然降血脂的相关药物也在不断的研发且得到了大量的采用，但是关于降血脂的药物或多或少会具有一定的副作用，而可以辅助降血脂的功能食品则不会有此影响。

现国内外大量的研究人员致力利用益生菌改善血清中的血脂水平，研究结果表明，一部分益生菌对于降低血清中的血脂具有显著的功效[11,12]。在认识了益生菌在对人体降低血脂有重要作用后，关于筛选降血脂的益生菌研究逐渐增多，但研究中多数对降血脂有作用的菌株都是来自于自然发酵食物中分离，对于来源于健康婴幼儿肠道中的乳酸菌降血脂的试验较少，因此本实验筛选样本来自于健康婴儿的肠道，筛选出的菌株通过体外降胆固醇、甘油三酯试验、胆盐耐受性试验得出较好的菌株，并进行形态鉴定、过氧化氢试验、16S rDNA 序列分析及电镜形态观察鉴定，以期获得降血脂性能较好的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品

实验样品为6 月龄顺产健康的婴儿粪便，确保婴儿在采样前没有服用过任何药物及乳酸菌产品，采样工具全部进行灭菌处理，并将样品采集好后套上厌氧袋并使用厌氧产气包进行运输。

1.1.2 试剂及培养基

胆固醇（C8667-1G）、牛胆盐（T4009-5G），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；邻苯二甲醛（化学纯CP）、硫代乙醇酸钠（分析纯AR），上海麦克林生化科技有限公司；正己烷（分析纯AR），天津市恒兴化学试剂制造有限公司；葵花籽油，中粮福临门食品营销有限公司；甘油三酯试剂盒（A110-1-1），南京建成生物试剂公司。

高胆固醇培养基（MRS-CHOL）：在根据王湘竹[13]研究所述方法配置MRS 培养基中加入0.3%牛胆盐，0.2%硫代乙醇酸钠，100 μg/mL 胆固醇溶液[14]。

甘油三酯培养基[15]：将2%的聚乙烯醇水溶液与植物油按体积比3:1 混合，用超声波处理（控制参数每次超声5 s，间隔时间5 s，共超声70 次）后混合均匀制成植物油乳化液作为甘油三酯的来源。将上述制备的植物油乳化液按5%的比例加入到MRS 培养基中，调pH 至6.5±0.2，在115 ℃下，灭菌30 min，将制备的甘油三酯培养基于4 ℃冰箱冷却备用。

1.1.3 仪器与设备

TGL-16M 型低温高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan FC 酶标仪，赛默飞世尔科技公司；QL-861 旋涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LAI-3DT 厌氧手套箱，上海龙跃仪器设备有限公司；PHS-25B 数字酸度计，上海大普仪器有限公司。

1.1.4 动物来源

金黄地鼠（许可证号：SCXK(辽)2020-0001），50只，雄性，90～110 g，购于辽宁长生生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离纯化筛选及鉴定

将6 月龄顺产健康的婴儿粪便稀释在平板上分离，37 ℃，48 h 后进行观察，找到典型菌落后，对其反复划线分离及纯化后获得纯菌株。通过革兰氏染色后镜检、过氧化氢酶试验进行鉴定，将疑似乳酸菌接种于MRS 斜面培养基上培养并于4 ℃保存备用[16,17]。

1.2.2 体外降胆固醇及降甘油三酯功能性筛选试验

1.2.2.1 体外降胆固醇功能性筛选（1）乳酸菌的活化

菌株接种5 mL MRS 培养基中，37 ℃，20±0.5 h，取培养物接种100 mL 上述培养基中，17 h 备用。

（2）胆固醇含量测定[18,19]

1 mg/mL 胆固醇溶液：用无水乙醇将0.1 g 胆固醇定容于100 mL 容量瓶中，0.22 μm 滤膜过滤除菌，4 ℃储藏备用。

图1 是胆固醇标准曲线，线性方程为y=0.0167x+0.0171，R2=0.9953，线性关系良好。

待用菌种接种于MRS-CHOL 培养基，以未接菌的MRS-CHOL 培养基作为对照。37 ℃培养24 h 后离心（6000 ×g，5 ℃，10 min），收集上清液，通过OPA法进行测定。

取上清液4.0 mL，加入2.0 mL 50% KOH，混和均匀后加入3.0 mL 95%乙醇，漩涡震荡后，将反应物置于60 ℃皂化15 min，加入3.0 mL 正己烷，混匀并加入2.0 mL 蒸馏水，漩涡震荡1 min，静置15 min。取2.0 mL 正己烷层溶液于干净离心管中，60 ℃氮吹挥发，加入2.0 mL 邻苯二甲醛溶液复溶，加入1.0 mL浓硫酸，漩涡震荡，测定OD550。

根据标准曲线测定样品中胆固醇含量

式中：

C0——未接种上清液中胆固醇实测浓度，μg/mL；

C——接种后发酵液上清液中胆固醇实测浓度，μg/mL。

1.2.2.2 菌株体外降甘油三酯功能性筛选

（1）乳酸菌的活化

菌株接种于5 mL 培养基中，37 ℃，培养20 h，取5 mL 培养物接至100 mL 培养基中，继续以适宜温度培养17 h，最后将菌液以3%接种量接种至100 mL适宜甘油三酯培养基及未接种菌液的适宜甘油三酯培养基中，37 ℃下培养24 h，待后续试验。

（2）单试剂法甘油三酯含量测定[20]

将培养后的菌液及未接种菌液的适宜甘油三酯培养基分别取10 mL，（6000 ×g，5 ℃，10 min）收集上清液。用96 孔板把样本、校准品、蒸馏水取2.5 μL分别加入样本空、校准孔和空白孔中，然后再加250 μL 工作液混合，37 ℃孵育，用酶标仪测定OD510值。

以如下计算公式计算未接种乳酸菌的甘油三酯培养基中甘油三酯TG 含量和接种乳酸菌的甘油三酯培养基中残留TG 含量。

用总TG 含量和残留TG 含量以如下公式计算乳酸菌的TG 降解率。

1.2.3 菌株的胆盐耐受性及耐酸性试验

将传代三次的菌液按照10%分别接种于空白对照和不同胆盐浓度及不同pH 的MRS 培养基中，37 ℃，17 h 培养，进行一系列的稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000 μL 进行活菌计数操作，每个稀释度2 次重复，37 ℃静置培养36～48 h 后测定活菌数。

不同条件处理，取样计数测得的活菌数（用N 表示）；空白对照试验中不同时间取样测得的活菌数（用N0表示）；

1.2.4 降血脂功能菌株的鉴定

通过SH-QO01-004-2019 生物学检测微生物菌种扫描电镜方法观察形态学特征、16S rDNA 基因序列测序及BLAST 程序进行同源性对比鉴定筛选出的降胆固醇及甘油三酯能力强且具有较高耐酸耐胆盐能力的菌株。扫描电镜检测委托中国工业微生物菌种保藏管理中心完成，16S rDNA 基因序列测序鉴定委托中国科学院微生物研究所完成。

1.2.5 体内降血脂试验

1.2.5.1 动物造模

选取金黄地鼠50 只，平衡饲养3 d 后，按体重随机分为5 组，每组10 只，5 组分别为：溶剂对照组，模型对照组，样品的低、中、高剂量组[21]。溶剂对照组采用基础饲料喂养，模型对照组、鼠李糖乳杆菌HCS01-013剂量组给予高脂饲料喂养7 d造模成功后，HCS01-013（6.5×1010CFU/g）剂量组按照1 g/k..g、2 g/k.g、4 g/k..g 剂量，灌胃喂养28 d，溶剂对照组与模型对照组每天灌胃等体积生理盐水。试验期间，各组实验动物自由摄.食、饮水，同时，密切观察动物体重生长情况以及给样对动物的影响[22]。

1.2.5.2 指标检测

给样结束后，各组试验动物禁食12 h，于眼眶后静脉丛取血，（6000 ×g，5 ℃，10 min）收集上清，应用甘油三酯试剂盒测定各组实验动物血清中甘油三酯含量。

1.3 数据统计分析

应用软件SPSS 22.0 进行数据处理分析。每组试验重复3 次，试验结果以平均值±标准差表示，采用t检验进行差异分析，p＜0.05 认为差异存在统计学意义。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

从婴儿粪便样品中筛选分离出6 株纯菌株，革兰氏染色阳性，菌落圆形，乳白色或白色，表面凸起，呈杆状，接触酶阴性，初步判断为乳酸菌[23]。

2.2 体外降胆固醇及降甘油三酯功能性的测定

2.2.1 体外降胆固醇功能性的测定

经邻苯二甲醛测定的6 株乳杆菌胆固醇降解试验（图2），由图中可知，各菌株对胆固醇降解率差异较大，其中3 株菌的体外降胆固醇能力较强，分别为B02-09、D05-08、HCS01-013，降解率分别为49.32%，35.93%，35.40%，其降解机制可能是通过吸附或共沉淀的方式达到的，比现有研究如王欢等[24]用邻苯二甲醛法筛选出的1 株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌（降解率为24.95%）及王今雨等[25]用邻苯二甲醛法筛选出的乳杆菌（胆固醇的降解率32.87%）降解率均高。

2.2.2 体外降甘油三酯功能的测定

经单试剂法（GPO-PAP）甘油三酯含量测定试验（图3），由图可知，各菌株对甘油三酯的降解率差异较大，菌株B02-09 为19.21%，C03-07 为35.73%、D05-08 为17.64%、E06-11 为13.29%、F08-04 为15.06%，HCS01-013 明显高于其他菌株（p＜0.05），降解率为44.20%。阿依米热·毛拉木等用甘油三脂试剂盒测定含量，筛选出具有降甘油三酯功能的植物乳杆菌[14]，其降解率为39.38%，干酪乳杆菌，降解率为28.43%，卢海鹏用甘油三酯试剂盒筛选出12 株具有降甘油三酯能力的鼠李糖乳杆菌，其中降解率最高的为22.4%[26]。菌株HCS01-013 的甘油三脂降解能力水平较高，可能也是通过吸附或共沉淀的方式降解，有待进一步研究，也可进一步用于在降血脂保健药品及功能保健食品的应用研究。

2.3 菌株的胆盐耐受性及耐酸性的测定

2.3.1 菌株的耐胆盐能力测定结果

正常人体的小肠分泌的胆汁酸浓度一般在0.3%左右，所以菌株需要在高胆盐环境下发挥作用，本实验选择4 个梯度（0.3%、0.5%、1.0%、1.5%）进行筛选，结果如表1。由表1 可见，在0.3%的胆盐浓度环境下，6 株菌的存活率达到95.00%以上，胆盐浓度提升到1.5%的环境下，活菌.数均有下降，仅有2 株菌存活率高于95.00%，其中HCS01-013 的存活率最高为96.79%。

表1 各菌株不同胆盐浓度中的活菌数及存活率Table 1 The number of viable bacteria and survival rate in different bile salt concentrations of each strain

2.3.2 菌株的耐酸环境能力测定结果

菌体进入到体内需要对相应较低酸环境，人体的胃酸pH 3.5～2.0 左右，所以菌株需要在低酸环境下发挥作用，本实验选择2 个梯度（pH 2.0 和pH 3.0）进行筛选，结果如表2。由表2 可见，在pH 3.0 的条件下，6 株菌的存活率达到85.00%以上，当降低到pH 2.0的条件下，活菌.数均有下降，仅有2 株菌存活率高于50.00%，综上所述，HCS01-013 对胆盐的耐受性及耐酸性较好。

表2 各菌株不同pH 中的活菌数及存活率Table 2 Number and viable rate in different pH of each strain

表3 菌株HCS01-013 的16S rDNA 序列同源性分析Table 3 16S rDNA sequence homology analysis of strain HCS01-013

2.4 功能菌株鉴定结果

根据降胆固醇、降甘油三酯及胆盐耐受性试验结果，菌株HCS01-013 具有较强的降血脂能力及胆盐耐受能力，因此将其作为目标菌株进行鉴定。电镜扫描显示菌株HCS01-013 菌体呈杆状，0.4～0.5 μm×0.7～1.3 μm，单个或成对排列，菌落呈圆形，表面凸起，白色，湿润且边缘整齐。结合BLAST 程序比对序列同源性分析及16s rDNA 基因序列测序鉴定结果，发现菌株HCS01-013 的基因序列与鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）的同源性为100%，在MEGA-X 图形界面下构建系统发育树，菌株HCS01-013 在系统发育树上Lactobacillus rhamnosusstrain JCM1136 在一个分支上（图5），因此鉴定菌株HCS01-013 为一株鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）。

2.5 HCS01-013 对高血脂症地鼠血脂影响

由表4 可知，造模第28 d，模型组与溶剂对照组相比，血清TG 含量显著升高，说明在本实验条件下，高血脂模型造模成功。经过28 d 小鼠灌胃处理，低、中、高剂量组血清TG 含量均明显下降，这说明在此剂量下鼠李糖乳杆菌对TG 有一定的调节能力。

表4 动物血清中甘油三酯含量（TG，mmol/L）Table 4 Serum triglyceride content of experimental animals in each group (TG,mmol/L)

3 结论

3.1 本实验从健康婴儿肠道中筛选乳酸菌，并对胆固醇与甘油三酯的降解率进行研究，首先将6 株菌株用邻苯二甲醛法进行胆固醇降解率测定，其中有3 株菌对胆固醇降解率高于35%，分别为B02-09，D05-08，HCS01-013。经单试剂法（GPO-PAP 法）测定6 株乳酸菌株的甘油三酯降解能力，结果菌株HCS01-013 甘油三酯降解能力最强，其降解率为44.20%，在耐酸试验中，菌株HCS01-013 耐酸能力最强，在pH 3.0 和pH 2.0 酸性条件下培养17 h，存活率能达到88.76%和71.34%。在胆盐耐受性的实验中，通过研究发现经过17 h 高浓度胆盐培养下各菌株的活菌数和存活率都有所下降，但是各菌株的存活率都能达到60%以上，均具有较强的耐胆盐的能力，其中HCS01-013 的胆盐耐受能力较为突出，在1.5%的胆盐浓度下存活率达96.79%。

3.2 尽管本次试验在降低胆固醇、降甘油三酯作用得到实验支持，但其机理尚未定论，目前通过实验能够看出在降血脂的两项体外试验中HCS01-013 的降解率相对较好，同时又具有较强的耐受酸及胆盐的能力。在对高血脂症地鼠试验结果表明，在高脂饲料的诱导下，血液中TG 含量可明显升高，经过28 d 的鼠李糖乳杆菌HCS01-013 喂养后，金黄地鼠血清TG 含量明显下降，这说明鼠李糖乳杆菌HCS01-013 表现出了有一定的体内降甘油三酯的能力。

3.3 在降胆固醇与降甘油三酯试验过程中所使用的为离心过后的上清液，在之后的实验中可考虑菌体吸收是否对试验有影响，并对其进行研究；在HCS01-013对高血脂症地鼠血脂影响中发现各剂量组之间没有表现出明显的降甘油三酯量效关系，这可能与该株菌降解甘油三酯机理或者给样时间较短有关。由于试验条件所限，本次试验仅对给样后金黄地鼠血清中甘油三酯含量进行了测定，之后可增加检测如低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等指标，考察鼠李糖乳杆菌HCS01-013对胆固醇转化的作用，以期更全面的了解该株菌株降血脂的机理，为后续的开发和应用提供数据支持。